FHIT基因微卫星不稳定性及人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系

王喜英，赵富玺，孟 健，刘润花，

(山西大同大学医学院,山西大同037009)

脆性组氨酸三联体基因 (fragile histidine triad,FHIT)是近年来发现的抑癌基因,位于3P14.2区域,该基因跨越人类染色体脆性部位FRA3B和家族性肾细胞癌相关的染色体交叉易位断裂点,它是第一个将染色体脆性易位点与肿瘤相联系的分子生物学证据.在调节细胞周期和凋亡中发挥作用[1].已有研究发现该基因与多种肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌等的发生发展有关.国内有关FHIT与宫颈癌及人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus,HPV)感染的研究还很少.本文对50例浸润性宫颈癌及40例宫颈上皮内瘤样病变 (Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)组织进行微卫星不稳定性(Midrosatellite instability,MI)及HPV感染的检测,旨在探讨FHIT基因在宫颈癌发生发展中的作用及其与HPV感染的关系.

1 材料和方法

1.1 样本来源

取2006年3月-2009年3月山西省肿瘤医院病理科石蜡存档样本为研究对象.其中CIN 40例,CINⅠ12例、CINⅡ13例、CINⅢ10例、原位癌5例,患者年龄23～68岁,中位年龄42岁;原发性浸润癌50例,患者年龄28～74岁,中位年龄53岁;另有鳞癌45例、腺癌5例.取正常宫颈组织20例为对照.所有病例的诊断均经病理检查确诊,所有癌症病例取材前均未行任何特殊治疗.

1.2 抽提DNA

每例样本各取10 μm石蜡切片,常规蛋白酶K消化,酚-氯仿-异戊醇抽提癌组织及正常组织DNA,用乙醇沉淀DNA,TE(Tris-Hcl和EDTA)缓冲液溶解后,-20℃保存备用.

1.3 样本组织微卫星DNA PCR扩增及LOH、MI判定

选取位于FHIT内的两个微卫星多态性位点D3S1234和D3S4103,引物序列(见表1)来自 Gen-Bank数据库,由日本Takara公司合成.50 μL反应体系中含DNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,10×buffer 5 μL,MgCL23 μL,dNTP 5 μL,TaqDNA聚合酶1 U,去离子水补至50 μL,石蜡油覆盖.PCR反应条件:94℃预变性5 min,后D3S1234按94℃30 s,62℃30 s,72℃45 s顺序扩增35个循环后,72℃延伸5 min;D3S4103按94℃90 s,56℃90 s,72℃60 s顺序扩增32个循环后,72℃延伸10 min.

表1 微卫星DNA标志引物序列、HPVPCR引物序列及相关参数

图1 D3S1234、D3S4103位点MI

10 μL PCR产物加2 μL上样缓冲液,混合均匀,上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶120 V电泳1 h 50 min后,银染,白炽灯下观察结果.结果判断:若肿瘤组织与相应正常组织对比,条带增多,位置改变或浓度增加判为MI[2](图1).

1.4 样本组织HPV PCR扩增和电泳

HPV16型E6基因引物的序列(见表1)由日本Takara公司合成.PCR反应条件为:95℃预变性8 min,后按94℃30s,50℃30 s,72℃1 min顺序扩增40次循环后,72℃延伸5 min.PCR产物用4%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察(图2).

图2 宫颈癌中HPV PCR结果

1.5 统计分析

运用SPSS 13.0统计软件对实验结果采用χ2检验进行分析,以α=0.05为检验水准.

2 结果

2.1 MI分析

浸润性宫颈癌在D3S1234和D3S4103位点上MI发生频率分别为18%(9/50)、14%(7/50).CIN在D3S1234和D3S4103位点上MI发生频率分别为12.5%(5/40)、7.5%(3/40).其中,在 D3S1234 位点上低级别CIN(CINⅠ,Ⅱ)和高级别CIN(CINⅢ,原位癌)的MI发生频率分别为12%(3/25)、13.3%(2/15).在D3S4103位点上低级别CIN(CINⅠ,Ⅱ)和高级别CIN(CINⅢ,原位癌)的MI阳性率分别为16%(4/25)、20%(3/15).随CIN级别的增加MI阳性率呈逐渐递增趋势.宫颈癌和CIN发生MI的差异无统计学意义(P＞0.05),但宫颈癌MI发生率均高于CIN.

45例鳞状细胞癌中在D3S1234位点上发生MI的频率为22.2%(10/45);在D3S4103位点上发生MI的频率为32%(8/45).5例腺癌中在D3S1234位点上有2例发生MI;在D3S4103位点上也有2例发生MI.差异无统计学意义(P＞0.05).

但腺癌组织中MI发生率高于鳞癌组织.

2.2 HPV16感染状况

50例浸润性宫颈癌组织中,HPV感染阳性患者为44例,占88%(44/50).CIN中HPV感染的频率为42.5%(17/40),而正常组中仅为5%(10/20).随着临床分期和组织学分级的增加,HPV感染率增加,但差异无统计学意义.CIN组中,低分化CIN感染率为24%(6/25),高分化CIN感染率为73.3%(11/15),且P＜0.05.

2.3 HPV16感染与MI的关系

数据见表2.宫颈癌中HPV感染的阳性、阴性样本在MI的发生率上的差异无统计学意义;CIN中HPV感染的阳性、阴性样本MI的发生率差异亦无统计学意义.

表2 MI与HPV的关系

3 讨论

MI是由DNA复制错误引起的简单重复序列的改变,表现为肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变.微卫星不稳定性的异常改变揭示基因的不稳定性,造成某些肿瘤抑制基因的失活,导致细胞增殖及分化异常,从而促进肿瘤的发生[3].

实验选取位于FHIT基因2个重要结构功能区外星子5和8附近的微卫星多态性位点进行MI分析,同时检测HPV16的感染状况,发现宫颈癌中FHIT基因在D3S1234位点的MI为18%,在D3S4103位点为14%,这与其他学者研究的结果相似[4].Hendyick等研究发现63%宫颈癌细胞系可检出异常的FHIT转录产物,包括多个外显子缺失.同时发现,一部分受累细胞系的FHIT等位基因发生了改变.实验提示宫颈癌患者的FHIT基因存在异常,在宫颈癌发生过程中有相应的缺失,同时存在突变.而且发现腺癌MI的发生率40%高于鳞癌22.2%,说明MI在宫颈腺癌中更具有特异性.

FHIT基因的微卫星不稳定性在宫颈癌发生发展中是一个诱发因子还是一个后期事件,各家的看法不一.Wistuba[5]通过对宫颈癌组织、CIN及正常宫颈组织研究推测FHIT基因异常可能不是病变的早期事件,而与肿瘤的恶性进展有关.Lonnolly[6]发现,FHIT基因在正常宫颈组织和早期CIN中均有广泛表达,而在71%宫颈癌和52%CIN中FHIT基因表达显著降低,因此推测FHIT异常是后期事件.Veuhione[7]等检测131例宫颈刮片,发现FHIT基因在正常细胞中表达正常,而在发育不良的细胞中表达减少,亦显示FHIT表达丢失发生在宫颈癌变过程的早期.据我们的实验显示,CIN在D3S1234点MI发生率为12.5%,在D3S4103发生率为7.5%，与宫颈癌在两个位点上的MI差异无统计学意义,但高级别CIN患者的MI高于低级别的CIN患者.因此我们推测FHIT基因的改变在宫颈癌的各个阶段都有发生,但在CIN后期发生率多一些.

已经明确HPV16是宫颈癌的致病因素,HPV16进入细胞后将其DNA整合于3号染色体的脆性部位即FRA3B处,而在FHIT基因起始编码外显子E5的着丝粒侧也发现了HPV16的整合点[8]．Butler[9-10]等研究发现,FHIT基因与HPV16感染有显著的统计学意义.本研究中,FHIT基因的MI阳性率不高,表明MI不是宫颈癌中FHIT基因失活的主要机制;但宫颈癌和CIN中,HPV感染的阳性组MI的发生率均高于阴性组,表明MI与HPV的感染存在一定的相关性.

目前FHIT基因的功能及作用机制仍未完全明确,许多问题尚待阐明.今后的深入研究将进一步揭示FHIT基因在肿瘤发生中的具体机制及其与其他癌基因、抑癌基因和病毒感染的关系.FHIT基因有望成为宫颈癌发生发展的敏感标志物,并用于肿瘤的早期诊断及预后分析．

[1]Roz L,Andriani F,Ferreira C G,et al.The apoptotic pathway triggered by the FHIT protein in lung cancer cell lines is not affected by bcl-X(L)overexpression[J].Oncogene,2004,23(56):9102-9110.

[2]Kiyoshi Y,Takayuki E,Takafumi N,et al.FHIT alterations in cancerous and non-cancerous cervical epithelium[J].Int J Cancer,2005,85(1):6-13．

[3]Blanes A,Diaz-Cano S J.Complementary analysis of microsatellite tumor profile and mismatch repair defects in colorectal carcinomas[J].World J Gastroenterol,2006,12(37):5932-5940.

[4]Huang L W,Chao S L,Chen T J.Reduced Fhit expression in cervicao carcinoma:correlation with tumor progression and poor prognosis[J].Gynecol Oncol,2003,90(2):331-337.

[5]Wistuba I I,Motellano F D,Milgbarub S,et al.Deletions of chromosome 3p are frequent and early events in the pathogenesis of uterine cervical carcinoma[J].Cancer Res,1997,57(15):3154-3158.

[6]Lonnolly D L,Greenspan D L,Wu R,et al.Lessof fhit expressinf in invasive cervical carcinomas and intraepithelial lesions associated with invasive disease[J].Clin Cancer Res,2000,6(9):3505-3510.

[7]Veuhione A,Eanesi N,Trombetta G,et al.Cervical dysplasia ploidy and human papillomavirus statis correlate with loss of Fhit expression[J].Chin Cancer Res,2001,7(51):1306-1312.

[8]Matthews C P,Shera K,Kiviat N,et al.Expression of truncated FHIT transcripts in cervical cancers and in normal human cells[J].Oncogene,2001,20(34):4665-4675.

[9]Butler D,Collins C,Mabruk M,et al.Deletion of the FHIT gene in neoplastic and invasive cervical lesions is related to high-risk HPV infection but is independent of histopathological features[J].Pathology,2000,192(4):502-510.

[10]Butler D,Collins C,Mabruk M,et al.Loss of FHIT espression as a poteneial marker of malignant progression in preinvasive aquarnous cervical cancer[J].Gynecol Oncol,2002,86(2):144-149.