食管鳞状细胞癌组织中乏氧诱导因子-1α蛋白和 mRNA的表达

吴欣爱,王筱璨,樊青霞,王留兴,李 鑫,王瑞林,姜中兴

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052 2)中南大学湘雅医学院临床医学专业2005级长沙 410008 3)郑州大学第一附属医院血液科 郑州 450052

#通讯作者,男,1965年生,硕士,教授,研究方向:白血病诊断与治疗,E-mail:jzx8888@yahoo.com.cn

由于乏氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)对肿瘤适应乏氧微环境起着关键作用,近年来受到更多学者的关注。研究[1]表明,人类多数肿瘤内都有显著的乏氧区域,多数肿瘤组织中存在 HIF-1α的高表达[2]。为了解食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)组织中HIF-1α的表达情况及其与临床病理特征的关系,作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 食管鳞癌组织标本及临床病理资料 收集2005年 11月至 2006年 8月郑州大学第一附属医院、郑州大学第二附属医院食管癌手术切除标本,共 46例。标本均在离体 0.5 h内,于冰上分离食管癌灶组织,置液氮中保存备用。46例中男 34例,女 12例;年龄 38～71岁,中位年龄55岁。所有患者术前均未进行任何放、化疗及其他特殊治疗。详细记载每例患者的性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、组织学分级及 TNM分期情况等临床病理资料[3]。另选同期行胃镜检查确诊为正常的食管黏膜组织(46例)作为对照,保存及观察方法同鳞癌组织。

1.2 食管鳞癌及正常食管黏膜组织中HIF-1α蛋白表达的免疫组化检测 石蜡标本 4μm厚切片,常规脱蜡至水。按照免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书的步骤操作。HIF-1α一抗工作浓度为 1∶50。参考文献[4]的诊断标准:于 200倍显微镜下随机观察 10个视野,以细胞胞质或胞核出现棕黄色颗粒着色者为阳性细胞;阳性细胞数＜10%为阴性表达,≥10%为阳性表达。

1.3 食管鳞癌及正常食管黏膜组织中 HIF-1α m RNA表达的RT-PCR检测 从液氮中取冻存组织约100mg,采用Trizol法分别提取2种组织中的总RNA,逆转录反应体系(20μL)组成:DEPC水7 μL,5×Buffer 4μL,dNTPs(10 nmol/L)2μL,Oligo (dT)1μL,RNase抑制剂1μL,总RNA 4μL,逆转录酶1μL。PCR引物序列:β-actin上游引物:5'-CATCCTGCGTCTGACCT-3',下游引物:5'-TCAGG AGGAGCAATGATCTTG-3',扩增产物大小为480 bp。HIF-1α上游引物:5'-CCTGCACTCAATCA AGAAGTTGC-3',下游引物:5'-TTCCTGCTCT GTTTGGTGAGGCT-3',扩增产物大小为618 bp。PCR反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s, 55.6℃退火30 s,72℃延伸1min,30个循环;再72℃继续延伸5min,置4℃保存。取PCR产物20 μL,分别加溴酚蓝6μL,混匀,加样于含有EB的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳(5 V/cm),电泳时间20 min。用凝胶成像分析系统分析照相,计算机分析读取各条产物带的灰度值,并与β-actin的灰度值相比,以此代表目的片段的相对表达值。以癌组织中HIF-1αmRNA与β-actin mRNA灰度值的比值大于平均值者为高表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 11.0进行分析,采用两独立样本t检验比较食管鳞癌及正常黏膜组织中HIF-1αmRNA的表达,采用χ2检验分析食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白和mRNA的表达与临床病理特征的关系,计算食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA与蛋白表达的关联性,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 食管鳞癌及正常食管黏膜组织中HIF-1α蛋白的表达 食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白阳性染色主要位于癌细胞胞质/核内,阳性率为 41.3%(19/ 46),而正常食管黏膜组织中 HIF-1α蛋白均呈阴性表达。见图 1。

图1 正常食管黏膜组织(A)及

2.2 食管鳞癌及正常黏膜组织中HIF-1αm RNA的表达 食管鳞癌组织及正常食管黏膜组织均可见HIF-1αmRNA的表达。食管鳞癌组织中HIF-1α mRNA的表达水平(1.17±0.25)高于正常食管黏膜组织(0.35±0.12)(t=13.942,P＜0.001)。46例鳞癌组织中HIF-1αmRNA高表达者24例,高表达率为52.2%。

2.3 食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA与蛋白表达的关联性分析 见表1。

表1 食管鳞癌组织中HIF-1αm RNA和蛋白表达的关联性分析 例

2.4 HIF-1α蛋白及mRNA的表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系 见表2。

表2 HIF-1α蛋白及mRNA的表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

HIF-1属于bHLH-PAS转录因子家族,基因定位于人染色体14q21～24,是一个由HIF-1α和HIF-1β组成的异二聚体结构,2个亚单位的相对分子质量分别为 120×103和(91～94)×103[5];研究[6]表明,HIF-1的亚单位HIF-1α是一个含826个氨基酸的多肽,在401～603区域有一个氧依赖降解区(oxygen-dependent degradation domain,ODD),它对氧的依赖性较强,主要起乏氧调节作用,决定 HIF-1的活性。

近年来研究[7-8]显示,在大多数人类正常组织中未检测到HIF-1α的表达,而在许多肿瘤组织中存在HIF-1α的过表达,且与预后密切相关。食管癌组织中HIF-1α表达的研究国内未见详细报道,而国外较少的研究报道结论不一[9-10]。作者的研究结果显示HIF-1αmRNA普遍存在于食管鳞癌组织及正常食管黏膜组织中,但在癌组织中的表达高于正常食管黏膜组织。食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白的阳性率为41.3%(19/46),而正常食管黏膜组织中呈阴性表达。有关HIF-1α阳性染色部位在不同的肿瘤中报道不一:肺腺癌细胞以胞质着色为主[11],而骨肉瘤细胞以胞核着色为主[12]。该研究显示食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白阳性着色位于癌细胞胞质/核内。这种组织器官着色部位的差异性机制有待于进一步的研究。

有研究[4]报道,HIF-1α与结肠癌的侵袭性和转移有关;而在肺癌中,HIF-1α的表达与肿瘤组织学类型无关,但与肿瘤的分期有关[13]。该研究结果显示:食管鳞癌组织中mRNA表达水平的高低与临床病理特征无关,但癌组织中mRNA表达水平的高低与HIF-1α蛋白阳性率的高低呈正关联,且HIF-1α蛋白的表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关。作者的研究结果提示食管鳞癌组织中HIF-1α在蛋白水平的表达更有临床意义。

[1]Vaupel P,Mayer A.Hypoxia and anemia:effects on tumor biology and treatment resistance[J].Transfus Clin Biol, 2005,12(1):5

[2]Lee JW,Bae SH,Jeong JW,etal.Hypoxia-inducible factor(HIF-1)alpha:its protein stability and biological functions[J].Exp Mol Med,2004,36(1):1

[3]周际昌.肿瘤内科治疗学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:11

[4]Jiang YA,Fan LF,Jiang CQ,et al.Expression and significance of PTEN,hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma[J].World JGastroenterol,2003,9(3):491

[5]Bos R,van der Group P,Greiger AE,et al.Levels of hypoxia-inducible factor 1 alpha indepentdently predict prognosis in patientswith lymph node negativebreast carcinoma [J].Cancer,2003,97(6):1 573

[6]Huang LE,Gu J,Schhau M,etal.Regulation ofhypoxiainducible factor 1 alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway [J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(14):7 987

[7]Ryan HE,Poloni M,McNu lty W,et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha is a positive factor in solid tumor growth [J].Cancer Res,2000,60(15):4 010

[8]Schindl M,Schoppmann SF,Samoningg H,et al.Overex-pression of hypoxia-inducible factor 1 alpha is associated with an unfavorable prognosis in lymph node-positive breast cancer[J].Clin Cancer Res,2002,8(6):1 831

[9]Kurokawa T,Miyamoto M,Kato K,et al.Overexpression of hypoxia-inducible-factor 1 alpha(HIF-1alpha)in esophageal squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis and pathologic stage[J].Br JCancer,2003,89 (6):1 042

[10]Koukourakis MI,Giatromanolaki A,Skarlatos J,et al. Hypoxia inducible factor(HIF-1αand HIF-2α)expression in early esophageal cancer and response to photodynamic therapy and radiotherapy[J].Cancer Res,2001,61 (5):1 830

[11]夏曙,于世英,袁响林,等.乏氧对肺腺癌细胞 A549细胞P糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的影响[J].中华医学杂志,2004,84(8):663

[12]吴强,杨述华,王锐英,等.干扰RNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对骨肉瘤细胞VEGF表达的影响[J].癌症, 2005,24(5):531

[13]Volm M,Koomagi R.Hypoxia-inducib le factor(HIF-1) and its relationship to apoptosis and p roliferation in lung cancer[J].Anticancer Res,2000,20(3A):1 527