双参数流式细胞术检测Molt-4和Jurkat细胞膜受体途径凋亡的始动位点*

杨长永,陈传波,陶德定,黄 丹,龚建平

1)河南大学公共卫生研究所开封 475004 2)华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤研究所武汉 430030△男,1978年生,硕士,讲师,研究方向:肿瘤分子生物学,E-mail:yangchangyong52@yahoo.com.cn

细胞凋亡是一种细胞周期事件[1]。细胞凋亡的细胞周期特异性即是处于不同细胞周期时相的细胞同时受到同样的“打击”,细胞均在细胞周期中的某一特定点走向凋亡[2]。细胞凋亡的途径主要有 2条:一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase;另一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase,即膜受体途径。活化的Caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞凋亡。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是典型的膜受体途径的细胞凋亡诱导剂。该实验中作者采用TNF-α诱导不同细胞凋亡,建立合理、稳定的膜受体途径的凋亡模型,并通过流式细胞术检测细胞凋亡的周期特异性。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 T淋巴细胞型白血病细胞株Molt-4与Jurkat购自武汉大学典型物保藏中心,外周血淋巴细胞(PBL)取自健康志愿者,均知情同意。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)与植物血凝素(PHA)购自晶美公司, TNF-α为英国 EC公司产品,淋巴细胞分离液为中科院血液所产品,FACSort流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 细胞培养 Molt-4与Jurkat细胞接种于体积分数10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、0.1 kg/L链霉素以及2mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基, 37℃、体积分数 5%CO2条件下培养。用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心(2 000 r/min 20 min)分离PBL,重悬于RPMI 1640培养基,调整细胞浓度为3×105mL-1,加入终浓度为10 mg/L的PHA,置细胞培养箱中,37℃、体积分数5%CO2条件下培养;对照组不加PHA。

1.3 细胞处理 取对数生长期的Molt-4与Jurkat (3×105mL-1)和加入PHA刺激的PBL(3×105m L-1),分别加入50μg/L TNF-α,培养6、12、18、24与36 h收获细胞。

1.4 细胞凋亡及细胞凋亡周期特异性检测 常规膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)法检测细胞凋亡:细胞离心去除培养基,以预冷(4℃)的结合缓冲液洗涤细胞,调整细胞浓度为 1×106mL-1,取100μL细胞加入Annexin V-FITC 5μL和PI 10μL,室温避光反应15min后流式细胞仪检测,CellQuest软件(BD公司)获取并分析数据。

API法检测细胞凋亡周期特异性[3]:收获细胞加入5μL Annexin V-FITC后,室温避光反应30 min,以预冷的结合缓冲液洗涤1次,加入1m L不含甲醇的体积分数1%的甲醛,冰上固定30min后,结合缓冲液洗涤2次,加入0.5mL PI染液[50mg/L PI,500mg/L洋地黄皂甙,10 mmol1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES),2 mmol CaCl2,0.1 mol NaCl],1 h后流式细胞仪检测。

细胞周期蛋白(Cyclin)/DNA双参数流式细胞术检测细胞周期特异性的始动位点:培养细胞收获后,用体积分数 80%冷乙醇固定,置于-20℃冰箱过夜,固定后的细胞用 PBS洗涤 2次,然后用体积分数0.25%TritonX-100在冰上处理5m in,以PBS洗涤2次,然后加入用体积分数1%BSA稀释的鼠抗人Cyclin E抗体(美国BD公司)0.25μg,4℃孵育过夜。次日细胞用PBS洗涤后,加入标有FITC的羊抗鼠IgG抗体(Sigma公司)(用体积分数1% BSA以体积比 1∶40的比例稀释),在室温下孵育30min。再次洗涤细胞后,用10 mg/L PI和1 g/L RNase A(Sigma公司)在室温下进行DNA染色20 min,采用流式细胞术分析。

2 结果

2.1 Annexin V/PI法检测细胞凋亡 对数生长期的Molt-4、Jurkat和加入PHA刺激的PBL加入TNF-α后,分别在 18、24和 24 h出现了较为明显的细胞凋亡。以早期细胞凋亡为主,凋亡率为 8%～18%。图1以Molt-4细胞为例说明。

2.2 API方法检测细胞凋亡的周期特异性 TNF-α诱导的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的细胞凋亡发生在G1期,维持周期特异性细胞凋亡的时间点分别为18、24和24 h。TNF-α诱导时间过短凋亡不明显,时间过长出现了其他细胞周期的凋亡细胞。图2以Molt-4细胞为例说明。

2.3 Cyclin/DNA双参数流式细胞术检测周期特异性细胞凋亡的始动位点 TNF-α诱导的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的周期特异性细胞凋亡的始动位点在细胞周期的G1早期。图3以PBL为例说明。

3 讨论

流式细胞术作为分子生物学的重要技术与方法,已成为研究细胞周期和细胞凋亡的重要手段。在过去的研究中,人们探索出了多种检测细胞凋亡的方法。如传统的Annexin V/PI法,但这种方法只能显示细胞凋亡率,不能直观而准确地显示细胞凋亡的周期特异性。该实验通过API法将细胞凋亡与细胞周期的检测紧密地联系在一起。这种方法使用的是非同步化的培养细胞,细胞总是处于细胞周期中。有研究[4]表明细胞周期可以更为详尽地分为 6期(G0期、G1早期、G1晚期、S期、G2期以及M期),而API方法只能按传统的细胞周期三分法进行细胞凋亡的周期特异性定位,不能更精确地显示周期特异性凋亡的始动位点。Cyclin/DNA双参数流式细胞术很好地解决了这一难题。Cyclins是一类呈细胞周期特异性表达﹑累积与分解的蛋白质,通过时相性激活细胞周期依赖性蛋白激酶驱动细胞周期的进行[5-6]。Cyclins的表达具有时相性[7]。Cyclin/ DNA双参数流式细胞术将单个细胞中Cyclin E的表达情况和细胞在细胞周期中所处的位置结合起来,对细胞周期进行较为详尽的区分。Cyclin E在G1早期合成,在细胞进入 S期时达到最高,并于细胞通过S期时逐渐被降解[8-9]。在Cyclin/DNA双参数流式细胞术的二维等高图中,G0期细胞不表达Cyclin E,G1早期细胞Cyclin E为弱阳性而G1晚期细胞为强阳性,将 G1期分为G1早期和G1晚期,同时将G0期与G1期分开。根据人类Cyclin E的表达模式图[4],该实验结果显示膜受体介导的细胞凋亡Cyclin E的表达降低,细胞被阻滞在G1早期而走向凋亡。

综上所述,Cyclin/DNA双参数流式细胞术可以精确而直观地反映受体途径的细胞凋亡与细胞周期的关系,从而为针对性地研究G1早期的细胞周期调控事件在凋亡过程中的作用提供良好的平台;为膜受体途径的细胞凋亡在肿瘤形成、生物治疗、自身免疫性疾病和神经系统退化性疾病发生中的作用提供理论指导。这一方法的实施中需要注意:不同细胞的周期特异性凋亡的最佳时间点不同,这可能与细胞膜的受体表达量有关,作用时间过长,过多的细胞碎片和代谢产物影响培养环境,如出现旁观者效应而影响结果的分析[10];可通过Annexin V/PI法选择最佳的凋亡时间点获得最稳定的凋亡模型,从而显示出典型的周期特异性。

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