曲古菌素A对食管癌细胞系EC1细胞凋亡的影响*

马俊芬,李 沛,黄幼田,杨洪艳,郑智敏,董子明

郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州 450001

#通讯作者,男,1953年生,博士,教授,研究方向:肿瘤发病机制及生物治疗,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)抑制剂,能抑制组蛋白去乙酰化酶的活性。它能够通过改变组蛋白的乙酰化状态,从而选择性地调控肿瘤相关基因,已成为一种新的肿瘤治疗制剂[1-2]。TSA对肿瘤的抑制作用可以表现在以下几个方面:细胞周期的阻滞,诱导凋亡及抑制血管增生。为了解 TSA对食管癌EC1细胞凋亡的影响,作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 RPMI 1640(美国Gibco公司),胎牛血清(天津TBD生物有限公司),TSA(美国Sigma公司),Annexin V-FITC试剂盒(江苏碧云天生物公司),Bax鼠抗人单抗及Bcl-2兔抗人单抗(美国Santa Cruz公司),食管癌EC1细胞(香港大学曹世华教授惠赠)。

1.2 细胞培养 EC1细胞在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中培养至对数生长期,然后分为 4组,实验 1、2及 3组分别用含 0.3、0.5和1.0μmol/L TSA培养,对照组用0.44 g/L的DMSO培养。

1.3 流式细胞仪检测凋亡细胞 分组作用 24 h后,收集细胞上清,用 0.5 g/L胰蛋白酶消化细胞,细胞悬液与上清液合并,离心,制备单细胞悬液,进行细胞计数。取至少 106个细胞移入新的 1.5 mL EP管中,190μL冰预冷 1×结合缓冲液重悬细胞,加10μL Annexin V-FITC轻轻混匀,室温避光放置10min,1 000 r/min离心5min,弃上清,加入195μL 1×结合缓冲液重悬细胞,加入5μL PI,室温避光孵育10m in。另设未染色管、单染Annexin V-FITC管及单染PI管;以未染色管调零机器,以Annexin VFITC单染管和PI单染管作为基准参照,测定每个上样管数据,利用CellQuest 3.0软件进行参数获取和资料分析,计算凋亡细胞百分比。

1.4 Western Blot检测Bax和Bcl-2蛋白的表达分组作用 24 h后,按照细胞总蛋白试剂盒说明提取总蛋白,Bradford法检测蛋白质的含量,50μg上样量,用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分离,转移至PVDF膜上,用50 g/L牛血清白蛋白封闭3 h,分别加入Bax和Bcl-2一抗,4℃过夜。将膜放于TBST稀释的二抗中,室温轻摇2 h,用TBST洗涤3次,使用HRP-ECL发光法显影,结果用Gel-Doc图像分析软件进行分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0进行统计学处理。4组细胞凋亡率和Bax、Bcl-2表达的比较行单因素方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞凋亡率测定结果 与对照组相比,实验1组细胞的凋亡率无明显变化,随着TSA浓度升高,实验 2、3组细胞凋亡率呈增加趋势,见表 1。

2.2 4组细胞Bax、Bcl-2表达的变化 与对照组相比,0.3μmol/L TSA处理后EC1细胞促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达无明显变化,0.5μmol/ L TSA处理后EC1细胞Bax的表达增加,而Bcl-2的表达减少,1.0μmol/L TSA处理后EC1细胞Bax的表达增加和Bcl-2表达减少更明显。见图1,表1。

图1 4组细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达

表1 4组细胞凋亡率(n=5)及Bax和Bcl-2蛋白表达(n=3)的比较

3 讨论

TSA源自链霉菌代谢产物,是一种强效HDAC抑制剂。HDAC抑制剂通过活化凋亡信号转导通路,促进凋亡相关蛋白的表达,诱导细胞凋亡。与细胞凋亡相关的信号转导通路主要包括死亡受体和线粒体凋亡信号转导通路。在死亡受体信号转导通路中Fas、FasL及TRAIL是主要蛋白,Insinga等[3]研究表明HDAC抑制剂丙戊酸可以通过选择性上调白血病细胞中Fas、FasL及TRAIL的表达,从而活化死亡受体凋亡信号转导通路,诱导白血病细胞凋亡。HDAC抑制剂还可以调控Bcl-2家族蛋白的表达和亚细胞定位,活化线粒体凋亡信号通路而诱导细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是一类调控细胞凋亡的蛋白,主要分为两大类:一类包括Bax、Bid、Bcl-xs等含BH3结构域的促凋亡蛋白,这些蛋白形成同源二聚体,嵌在线粒体膜上,通过增强线粒体膜通透性,促进细胞色素c(Cytc)和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)的释放,诱导细胞凋亡;另一类是抗凋亡蛋白,包括Bcl-xL和Bcl-2,这些蛋白过表达后与Bcl-2家族中的促凋亡蛋白结合形成异源二聚体,从而阻断Cytc和AIF的释放,抑制细胞凋亡[4]。

作者分别用0.3、0.5、1.0μmol/L TSA培养细胞24 h,用Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞仪检测EC1细胞的凋亡情况。结果显示,与对照组比较,0.3μmol/L TSA处理24 h后细胞凋亡率没有明显变化,0.5μmol/L TSA处理后EC1细胞凋亡率增加;随着TSA作用浓度的增加,Bax的表达量增加,而Bcl-2则减少。表明TSA可以引起促凋亡基因蛋白Bax表达上调和抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调,从而引起EC1细胞凋亡,其机制可能为:一方面TSA可以在转录水平上调Bax和下调Bcl-2蛋白的表达水平,使线粒体膜的通透性增强而活化线粒体凋亡信号通路[5-7];另一方面TSA通过调控Bcl-2家族蛋白的亚细胞定位诱导细胞凋亡,这种作用和细胞质中DNA末端识别和结合蛋白Ku70蛋白密不可分,Ku70可与Bax结合,抑制Bax向线粒体膜的转运。TSA促进Ku70的乙酰化水平,使其释放与之结合的Bax[8]。Bax转运到线粒体膜上,形成同源二聚体,增强线粒体膜的通透性,引起Cytc的释放,诱导EC1细胞的凋亡。Bax既可以自身形成同源二聚体,又可以与 Bcl-2结合成异源二聚体并定位于质膜上,Bcl-2与Bax的结合是Bcl-2发挥作用的前提。当 Bax在细胞内过量表达,形成同源二聚体增多,破坏了Bcl-2与Bax的结合。与Bax分离的Bcl-2失去抗凋亡能力,使细胞对死亡信号的反应增强。

总之,TSA作用EC1细胞后可以通过调控Bcl-2家族蛋白的表达和亚细胞定位两个方面,活化线粒体凋亡信号通路,诱导细胞凋亡[9],但是否还与其他基因的表达改变有关尚有待进一步研究。

[1]Marks PA,Miller T,Richon VM.Histone deacetylases[J]. Curr Opin Pharmacol,2003,3(4):344

[2]Habold C,Poehlmann A,Bajbouj K,et al.Trichostatin A causes p53 to switch oxidative-damaged colorectal cancer cells from cell cycle arrest into apop tosis[J].J Cell Mol Med,2008,12(2):607

[3]Insinga A,MonestiroliS,Ronzoni S,etal.Inhibitors of histone deacetylases induce tumor-selective apoptosis through activation of the death receptor pathway[J].Nat Med, 2005,11(1):71

[4]Zhao LY,Niu Y,Santiago A,etal.An EBF3-mediated transcriptional program that induces cell cyclearrest and apoptosis[J].Cancer Res,2006,66(19):9 445

[5]Kang MR,Kang JS,Han SB,et al.A novelδ-lactam-based histone deacetylase inhibitor,KBH-A 42,induces cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2009,78(5):486

[6]李云龙,邹小明,袁友萍,等.曲古菌素 A对胃癌细胞系BGC-823组蛋白H 4乙酰化水平及细胞凋亡的作用[J].肿瘤学杂志,2008,14(8):654

[7]Woo HJ,Lee SJ,Choi BT,et al.Induction of apop tosis and inhibition of telomerase activity by trichostatin A,ahistone deacetylase inhibitor,in human leukemic U937 cells[J]. Exp Mol Pathol,2007,82(1):77

[8]Subramanian C,Opipari AW Jr,Bian X,et al.Ku70 acetylation mediates neuroblastoma cell death induced by histone deacetylase inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(13):4 842

[9]Ahn MY,Lee J,Na YJ,etal.Mechanism of apicidin-induced cell cycle arrest and apoptosis in Ishikawa human endometrial cancer cells[J].Chem Biol Interact,2009, 179(2/3):169