电针结合经颅磁刺激对局灶性脑缺血大鼠NeuN表达的影响

黄国付，黄晓琳

(1.武汉市中西医结合医院针灸科,湖北 武汉 430022；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院康复医学科,湖北 武汉 430030)

缺血性脑卒中为常见的脑血管疾病，致残率和致死率均较高。对于大多数脑缺血患者而言，神经元死亡不可避免，如何积极有效地促进缺血性脑卒中患者神经功能的恢复仍然是目前脑缺血的研究重点。前期研究表明，电针 （electro-acupuncture，EA）结合经颅磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS）治疗能促进大鼠神经干细胞（neural stem cell，NSC）的增殖，改善大鼠学习记忆能力[1]。本研究采用免疫组化进一步观察电针结合rTMS对局灶性脑缺血大鼠不同时相、不同脑区神经核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)表达的影响，以探讨其在脑缺血神经修复中的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性清洁级Wistar大鼠120只，体质量为(200±20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXR（鄂）2009-0007。

1.1.2 仪器 石蜡切片机(Leica 2025型，德国)，生物显微镜(Olympus BS-50型，日本)，CCD数码相机(Canon 970型)，图像分析系统(HPIAS21000)，G6805-1型电针治疗仪(青岛华青仪器厂)。

1.1.3 试剂 5-嗅脱氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine，BrdU）、小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体，免疫组化染色试剂盒包括生物素化抗小鼠抗体(二抗)、亲和卵白素化过氧化物酶(三抗)均购于Sigma公司；小鼠抗大鼠NeuN单克隆抗体购于Vector公司;大鼠来源BrdU抗体购于Serotec公司；PBS、多聚赖氨酸、异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗小鼠荧光二抗、Cy3标记的羊抗小鼠荧光二抗及SABC免疫组化试剂盒购于北京中山生物技术公司；正常山羊血清，DAB购于武汉BOSTER公司；去离子甲酰胺、TritonX-100、AEC试剂盒购于晶美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将120只动物随机分为正常组、模型组、电针组、rTMS组和电针结合rTMS组(结合组)。参照廖维靖等[2]的大鼠大脑中动脉缺血模型造模方法，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型。术后24 h采用Bederson标准［3］初步评分并进行筛选。0分:未见行为缺陷; 1分:左前肢屈曲(提尾悬空实验阳性);2分:侧推抵抗力下降(侧向推力实验阳性)，伴左前肢屈曲，无转圈行为;3分:同2分行为，伴自发性旋转。选择评分为1～3分的大鼠纳入本研究。选取1 d作为开始治疗的时间点，按7、14、28 d 3个时相点分为3个亚组，每个时相点取4只用于免疫组化检测。

1.2.2 干预方法 正常组和模型组造模后当日开始按同等条件抓取，但不实施电针及rTMS处理；电针组采用督脉电针的刺激方式，以橡皮筋将大鼠四肢固定在治疗台上，参照《实验针灸学》[4]选取督脉经穴“百会”、“大椎”，以30号1寸毫针斜刺入 “百会”10 mm，直刺入 “大椎”5 mm，将针柄分别连接至电针仪上，选取连续波，频率为20 Hz，强度为1～2 mA。在手术2 h后即进行第1次治疗，每次治疗30 min，1次/d。rTMS组采用丹麦Dantec公司生产的磁刺激器及圆形线圈，线圈的直径为12 cm，脉冲磁场的强度峰值为2T。刺激时固定大鼠头部，线圈紧贴头皮，与大鼠右侧大脑半球相切，中心位于动物右耳前9 mm，在手术2 h后即进行第1次治疗，刺激频率为0.5 Hz，强度为70%最大输出强度，连续刺激20次为1组，2组/d，至各时间点大鼠处死前1 d结束。结合组参数与疗程分别同电针组和rTMS组。

1.2.3 神经功能缺损评分 参照Bederson等［3］的评分方法，分别于7、14、28 d 3个时间点处死前观察大鼠行为表现并进行神经功能缺损评分。

1.2.4 切片制备 分各组大鼠分别于7、14、28 d 3个时间点处死前12 h内每4 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg 1次，共3次，于最后1次注射后4 h用6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射深度麻醉，行左心室升主动脉插管，剪开胸腔暴露心脏，剪开心包膜，用恒流泵经过心脏灌注肝素化生理盐水250 mL，灌注4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 M，pH 7.4)350 mL，之后立刻断头取脑，放入4℃的4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 M，pH 7.4)过夜，固定不超过24 h，于颞叶以梗死灶为中心冠状切脑，包括梗死灶周围皮质、海马、侧脑室等，洗净脑组织表面的固定液，随后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，石蜡切片机连续冠状位切片(片厚20 μm)，每隔5张取1张。每只大鼠随机取3张连续切片，每部位各随机取3个非重叠视野进行计数，采用HPIAS21000图像分析软件进行光密度半定量分析。

1.2.5 NeuN免疫组化 （1）冰冻切片从冰箱取出后经-20℃冰箱回温10 min，再经-4℃冰箱4%多聚甲醛固定15 min；（2）滴加3%H2O2-甲醇20 min以阻断内源性过氧化物酶；（3）经枸橼酸盐 （pH 6.0）微波抗原修复 （温度95℃，15 min），滴加正常封闭血清，室温1～2 h；（4）滴加小鼠抗NeuN(抗体效价1∶100)，4℃冰箱过夜；（5）滴加生物素化二抗和SA-HRP溶液1∶200，室温1 h；（6）以上各步骤间都用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗3次每次5 min，镜下DAB-H2O2适度显色，显色后常规脱水，透明，封片；（7）替代实验：阴性对照采用PBS代替一抗。结果判定:NeuN的表达以细胞核为主，少数表达在胞浆。

1.2.6 NeuN/BrdU标记细胞免疫荧光照相 （1）BrdU阳性细胞的免疫荧光标记：①在65℃下用50%甲酞胺和柠檬酸钠溶液孵育脑切片 2 h；②PBS洗 5 min×3次，4 mol/L盐酸室温孵育30 min；③PBS洗5 min×3次，0.1 mol/L硼酸溶液室温孵育20 min，行DNA变性；④PBS洗5 min×3次后，含有0.1%Triton-X100的10%小牛血清封闭孵育2 h；⑤甩去封闭液加BrdU单克隆抗体(1∶200)4℃过夜；⑥PBS洗5 min×3次后加相应荧光二抗(Cy3标记驴抗兔)，孵育1 h；⑦PBS洗5 min×3次后50%甘油封片，荧光显微镜下照相。（2）BrdU/NeuN标记细胞：①切片按上述BrdU标记方法行酸变性及核变性后；②PBS洗5 min×3次后，用含有0.1%Triton-X100的10%小牛血清孵育2 h；③封闭液加BrdU（1∶200）/NeuN（1∶100）抗体4℃过夜；④洗5 min×3次后加相应荧光二抗，孵育1 h；⑤PBS洗5 min×3次后50%甘油封片，荧光显微镜下照相。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 电针结合rTMS对大鼠缺血后神经行为学评分的影响

Bederson神经功能评定正常组得分均为0，电针组、rTMS组、结合组与模型组在7、14、28 d相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，结合组与电针组、rTMS组相比差异有统计学意义 (P＜0.05)。结果见表1。

表1 对各组大鼠不同时间段缺血后神经功能缺损评分比较 （n=8，±s，分）

表1 对各组大鼠不同时间段缺血后神经功能缺损评分比较 （n=8，±s，分）

注：与模型组比较★★P＜0.05；与电针、rTMS组比较▲▲P＜0.05。

组别正常组模型组电针组rTMS组结合组7 d 0 2.75±0.46 2.00±0.53★★2.00±0.53★★1.36±0.52★★▲▲14 d 0 2.50±0.53 1.75±0.46★★1.63±0.52★★1.00±0.53★★▲▲28 d 0 1.63±0.52 0.88±0.35★★1.00±0.53★★0.25±0.46★★▲▲

2.2 电针结合rTMS对大鼠海马NeuN阳性表达的影响

NeuN正常组仅有少量稀疏表达，染色淡；海马颗粒下区（SGZ）和侧脑室下区（SVG）缺血后7 d即有NeuN阳性细胞的表达明显增加，14 d表达明显达到高峰，28 d表达开始下降；NeuN/BrdU标记细胞数在正常组几乎没有表达，缺血后7 d表达增加，14 d表达达到高峰，28 d表达下降，仍高于正常组。增加最明显的为结合组，电针组和rTMS组也有明显增加，但电针组和rTMS组之间无显著性差异，模型组增加最少；从组间比较看，电针组、rTMS组、结合组与模型组在7、14 d时差异有统计学意义 (P＜0.05)，结合组在7、14 d时均高于电针组和rTMS组(P＜0.05)，电针组、rTMS组、结合组与模型组在28 d相比NeuN及NeuN/BrdU阳性细胞数目均无显著性差异。结果见表2～3。

表2 对各组大鼠缺血后不同时间SGZ和SVZ NeuN阳性细胞数量比较 （n＝4，细胞数/mm2，±s）

表2 对各组大鼠缺血后不同时间SGZ和SVZ NeuN阳性细胞数量比较 （n＝4，细胞数/mm2，±s）

注:与模型组比较☆P＜0.05；与电针组、rTMS组比较△P＜0.05。

SGZ SVZ组别正常组模型组电针组rTMS组结合组7 d 19.32±6.86 50.25±13.26 100.59±13.98 95.87±15.32☆132.18±16.29☆△14 d 18.25±6.73 86.02±15.36 156.28±14.15 155.67±15.22☆207.91±15.62☆△28 d 17.07±6.71 32.92±13.71 36.29±13.75 33.72±14.19 36.52±15.22 7 d 11.32±5.56 43.26±12.25 93.95±14.89☆87.32±13.87☆105.28±15.18☆△14 d 12.37±5.31 71.36±13.02 147.15±15.28☆139.22±16.68☆193.62±16.91☆△28 d 11.53±5.22 25.91±13.29 30.75±11.16 27.17±12.72 32.55±13.07

表3 对各组大鼠缺血后不同时间SGZ和SVZ NeuN/Brdu阳性细胞数量比较 （细胞数/mm2，n＝4，±s）

表3 对各组大鼠缺血后不同时间SGZ和SVZ NeuN/Brdu阳性细胞数量比较 （细胞数/mm2，n＝4，±s）

注:与模型组比较☆P＜0.05；与电针组、rTMS组比较△P＜0.05。

SGZ SVZ组别正常组模型组电针组rTMS组结合组7 d 13.16±6.22 25.26±14.56 38.27±14.87☆35.39±15.12☆102.16±16.07☆△14 d 13.15±6.13 36.32±15.59 77.68±15.35☆72.51±16.02☆157.11±17.29☆△28 d 12.51±6.29 27.93±13.67 33.69±14.45 29.12±13.76 35.02±15.37 7 d 8.65±3.03 35.65±12.95 71.78±13.07☆69.91±11.21☆86.01±15.71☆△14 d 3.32±3.21 51.59±13.32 115.35±15.73☆111.07±15.95☆156.22±16.77☆△28 d 3.91±3.05 17.67±11.03 21.54±12.01 19.67±11.37 27.25±12.07

3 讨论

成年脑内的NSCs处于相对静止状态，当环境因素的强度达到引起其增殖的阈值时，NSCs才开始进行自我复制，同时新产生的神经细胞遵循一定的规律进行迁移，到达指定的位置后，按所处环境因素的决定分化成相应区域的神经元细胞、神经胶质细胞或神经系统的其他功能细胞，以替代由损伤等原因引起的神经细胞缺失并重建神经功能[5]。为了解大鼠脑梗死治疗前后细胞增殖情况，我们采用免疫组化方法对BrdU的阳性表达进行了检测。结果观察到无论电跳台实验还是BrdU免疫组化结果均显示电针结合rTMS组均优于单纯的电针组或rTMS组，证实电针结合rTMS能更有效地促进大鼠NSCs的增殖，两者具有相互促进的作用。

NeuN为神经元的特异性标志物，为胞核表达。在本实验中，缺血后7 dNeuN和NeuN/BrdU阳性细胞的表达明显增加，14 d表达达到高峰，28 d表达开始下降，但仍高于正常组。增加最明显的为电针结合rTMS组，电针组和rTMS组也有明显增加，模型组增加最少；从组间比较看，电针组、rTMS组、电针结合rTMS组与模型组在7、14 d时有显著性差异，电针结合rTMS组在7、14 d时均高于电针组和rTMS组，与Iwai等[6]的研究结果相比可见，电针结合rTMS干预后，NSCs的分化有不同程度的提前。

综上所述，缺血损伤后不同脑区出现了神经前体细胞增殖，随病程延长逐渐向成熟细胞过渡，最终分化为成熟的神经元。电针结合rTMS激活内源性NSC或神经先祖细胞的增殖、分化及整合，促进了神经再生及损伤后神经功能的恢复。但其对NSCs分化的作用机制有待进一步研究。

[1]彭 力，黄晓琳，韩肖华，等.电针结合经颅磁刺激对脑缺血大鼠神经干细胞增殖和电跳台的影响[J].中国中医急症，2008，17(2): 206-208.

[2]廖维靖，刘淑红，范 明，等.线栓阻断大鼠大脑中动脉制作缺血性脑损伤模型的改良[J].中华物理医学与康复杂志，2002，24(6): 345-349.

[3]Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3):472-476.

[4]邓春雷，殷克敬.实验针灸学[M].北京:人民卫生出版社，1998:143.

[5]Gage F H.Maminalian neural stemcells[J].Science，2000（287）：1 433-1 438.

[6]Iwai M，Sato K，Omopi M，et al.Three steps of neural stem cells development in the gerbil dentate gyrus after transient isehemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，2002，22:411-419.