环境中甾体激素降解菌的筛选及功能基因的克隆

于源华，宋禹，何秀霞，王宝德，刘华，李金海，熊光明

(1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.长春卫尔赛生物药业有限公司，长春 130022)

随着工农业的发展，水资源甾体激素污染愈加严重，这不仅仅危害人类健康而且危及到所有动物的生存和发展[1]。甾体激素在江水、河水、湖水及海水中都被检出[2-3]。其含量超标可能造成男性女性化，还将引起男性前列腺癌，女性乳腺癌等[4]。

另有美国Julio E.Cabrera学者[9]报道了3,17-羟基类固醇脱氢酶基因，其编码的3,17-HSD能够降解固醇类固醇激素，如果从中国领域内筛选到相关的菌种并克隆出关键基因将为我们治理日益严重的环境激素污染起到重要作用。

1 材料

海水样品：采样地点位于大连海港附近，疑为被城市甾体激素污染。

菌种：HB101(实验室保存)。

质粒：pCR2.1-TOPO(Invitrogen购买)。

试剂：LB培养基，SIN培养基，kannmycin(北京鼎国)，雌二醇，睾丸酮，胆固醇(sigma)，3-HSD/CR兔抗体(本实验室制备)。

仪器：荧光酶标仪(BioTek)，全温振荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)，电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，日立CF-16RX高速冷冻离心机，紫外分光光度计(日立U-2800)PCR仪(eppendorf)。

2 方法

2.1 环境中甾体激素降解菌的筛选

从大连海港8个不同地点取了8种水样。将水样至于50mL离心管中，4000rpm，离心10min。取靠近底部沉淀物的2mL水至于EP管中，取400uL在含有2.6%NaCl和1mM睾丸酮的SIN琼脂糖培养基上涂布，27℃过夜培养。挑取8个平板的单菌落(每个平板5个单菌落)到50uLSIN培养基中并编号记录，混匀后各取2uL分别在A(无睾丸酮)和B(含有1mM 睾丸酮)平板上点样。27℃过夜培养。A、B平板为1:10稀释的SIN琼脂糖培养基，含2.6%NaCl。

2.2 H5-1菌株的培养

H5-1菌株在含2.6%NaCl的 LB培养基中，27℃，180rpm，恒温摇床里培养12h备用。接于新的含2.6%NaCl的LB培养基中，27℃，180rpm恒温摇床里扩大培养5-6h备用。H5-1菌株在含 kan(30g/ml)2.6%NaCl的 LB 培养基，27℃，180rpm的恒温摇床里培养12h备用。

2.3 ELISA检测3-HSD/CR

2.4 3，17-羟基类固醇脱氢酶(3，17-HSD)目的基因的克隆

根据GeneBank中报道的EF488080.1的3,17-HSD基因序列设计上下游引物，以 H5-1染色体DNA为模板，上游引物 P3-17L:5'-CATATGACAAATCGTTTGCAG-3'，下游引物P3-17R:5'-GGATC CATCTATAGCCCCATG-3'得到765bp的3,17-HSD基因片段。将该片段与载体 PCR2.1-TOPO连接制得pTOPO-3,17-HSD并转化到HB101感受态细胞中，通过Kan、Amp双抗性筛选得到HB-17突变菌株。再通过电击与 H5-1菌株杂交，抗性筛选出H5-1突变株。

2.5 ELISA检测3，17-HSD

为了定量3,17-HSD，建立 ElISA检测方法，抗 3,17-HSD兔抗体由本实验室按照标准方法制备。将含3,17-HSD蛋白样品包被在酶标板上，蛋白含量定于 1mg/mL，封闭洗涤之后每孔加入200uL1:10000稀释的3,17-HSD抗体，加入二抗染色终止。

图1 筛选降解水中雌激素的细菌Fig.1 The bacteria of estrogen in screening degradated water

图2 H5-1的显微镜下结构观察图Fig.2 The structure graph under HS-1 microscope

图3 不同温度条件下甾体激素诱导H5-1表达3-HSD/CR蛋白Fig.3 The steroid hormone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different temperature

图4 不同浓度的甾体激素诱导H5-1表达3-HSD/CR蛋白Fig.4 The steroed homone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different density

图5 H5-1菌株对胆固醇的降解作用Fig.5 The degradation of cholesterol by strain

3 结果

3.1 菌株筛选

通过27℃过夜培养，所有的40接种单菌落在B平板上均能良好生长，只有8个接种单菌落不能在A平板上生长(图1)。很明显，这8个菌落在B平板上可以利用睾丸酮作为碳源生长，而在同样低营养条件且不含睾丸酮的A平板上无法生长。根据进一步的筛选，(第3次接种于1：10稀释的SIN琼脂糖培养基，含2.6%NaCl，1mM睾丸酮)从这8单菌落中得到一个单菌落，这种菌具有与睾丸酮丛毛单胞菌相似的特性，命名为H5-1。

A、B均为1：10稀释的SIN培养基且含2.6%NaCl，B中另含有1mM睾丸酮。

经过革兰氏染色后的 H5-1的显微镜下照片显示为革兰氏阴性菌(图2)。

3.2 H5-1中3-HSD/CR活性

在不同浓度和不同温度条件下H5-1被雌二醇，睾丸酮诱导均可以使3-HSD/CR不同程度大量表达，但被胆固醇诱导3-HSD/CR表达量却没有增加。而且H5-1最适诱导温度为27℃至37℃，最适诱导浓度为0.3mM(图3、4)。

3.3 H5-1对胆固醇的降解

为了确定H5-1的降解能力及H5-1是否对胆固醇有降解作用，我们将培养好的 H5-1菌液加入到已知胆固醇含量的测试液中，恒温27℃，1h后检测测试液中的胆固醇含量。

由加入 H5-1菌液前后测试液中的胆固醇浓度可知，27℃1h后，测试液中0.5mM的胆固醇80%以上被降解(图5)。

3.4 3，17-HSD的基因克隆

图6 3，17-HSD基因PCR电泳图Fig.6 The electrophoretic graph of 3，17-HSD gene

此图显示了3条PCR扩增条带，分别是740bp、600bp、380bp。

4 讨论

该基因的成功克隆，为本课题组进行目的蛋白的表达、酶活性测定研究及利用分子克隆技术将绿色荧光蛋白报告基因(GFP)通过同源重组整合进H5-1染色体 DNA中，构建出H5-1荧光变异菌株奠定了工作基础。

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