猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

李艳蕊 ，李学伍 ，王 丽，刘 磊，张改平

（1.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070；2.河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002）

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种以高热和出血为特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重大传染病之一，被世界动物卫生组织（OIE）列入A类疾病名录[1]，我国也将猪瘟列为一类动物疫病。CSFV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员，其基因组为长约12.3 kb的线状单股正链RNA，含有单一的开放阅读框架（ORF），编码3 898个氨基酸残基，有4种结构蛋白（衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2）以及8种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）[2-3]。其中 Erns、E2 是病毒诱导机体产生中和抗体的两个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附进入敏感细胞的必须蛋白。Erns不具有跨膜区，而是以一种未知机制连接在病毒粒子表面，本身既是包膜结构蛋白，又是一种核苷酸酶[4]。尽管针对Erns的单抗也能中和病毒，但Erns在天然宿主中的体液免疫保护作用机制仍不清楚[5-6]。目前，国内外完成的对猪瘟病毒的研究主要集中在应用不同的载体来表达E2蛋白作为诊断及免疫[7]，而Erns应用研究则相对较少。

毕赤酵母表达系统是目前比较成熟的真核表达系统之一，本研究通过毕赤酵母表达系统对CSFV Erns蛋白进行体外重组，旨在为研制以此蛋白为诊断抗原的CSFV ELISA定型诊断试剂盒奠定基础。同时对于研究CSFV的结构与功能也有重要的作用。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒

E.coli JM109、P.pastoris GS115和 P.pastoris整合型分泌表达质粒pPIC9K由河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室保存。

1.2 试剂及工具酶

酵母完全培养基（YPD）、选择培养基（MD）、甲醇选择培养基（MM）、诱导培养基（BMGY）和甲醇诱导培养基（BMMY）按Invitrogen公司说明书配制；Plasmid Miniprep kit和 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0以及各种限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和 T4 DNA 连接酶、Ex taq 酶购自TaKaRa公司；Tryptone、Yeast为OXOID产品；YNB为Solarbio产品；

DL2000 DNA Marker、λ-EcoT14 Idigest Marker、λ-Hind Ⅲdigest Marker、低分子质量蛋白质Marker购自TaKaRa公司；四甲基氨基甲烷（TEMED）、D-山梨醇等购自Promega公司；过氧化物酶标记的二抗等为Sigma公司产品；所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 引物的设计及合成

根据GenBank中登录的猪瘟Erns基因序列，设计合成特异性引物，并在5′端加EcoRⅠ位点，3′端加 NotⅠ位点。引物序列如下：Erns 5′：5′-GGGGTACCGAGATAAAAGTTAATCCTCCTCAG-3′（引入EcoRⅠ酶切位点及保护性碱基），Erns 3′：5′-CCCAAGCTTCTATCCATG GACTTTG-3′（引入NotⅠ酶切位点及保护性碱基）；根据甲醇酵母乙醇氧化酶1（AOX1）基因两端序列设计的引物序列如下 ：5′AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC －3′；3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。引物由上海生工生物制品公司合成。

1.4 PCR扩增Erns基因及基因片段的回收

以Teasy-Erns质粒为模板，PCR反应条件如下94℃ 2 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸10min。4℃保存PCR产物，并经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。从琼脂糖凝胶中切下目的Erns片段，用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒回收。

1.5 p PIC9 K-Erns重组质粒的构建及鉴定

将Erns基因及pPIC9K质粒载体均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶双切，琼脂糖电泳，回收酶切片段；将双切后的Erns基因片段及pPIC9K片段用T4 DNA连接酶进行连接；连接产物转化感受态E.coli JM109（AMP+），用含 AMP+的 LB 平板筛选阳性重组子。通过酶切、PCR和测序等方法鉴定阳性克隆，命名为pPIC9K-Erns。

1.6 电穿孔转化及PCR方法筛选重组子

将重组表达质粒pPIC9K-Erns和空质粒p PIC9 K 用 SalⅠ酶切线性化，在 1.5 kV、20 μF、400 Ω的条件下将其转化到Pichi apastoris GS115酵母感受态中，取400μL铺于MD平板上，28℃培养3 d。挑选生长良好的单菌落接种于2 mL YPD培养过夜后，取新鲜的菌液3μL进行PCR[8]，所用引物为 5′AOX1：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。

1.7 His+Mut+和His+Muts表型的鉴别

挑取筛选到的重组子单菌落分别接种MD和MM平板，28℃培养3 d。在2种平板上均生长良好的菌落为His+Mut+表型菌落。在MD平板上生长迅速，而在MM平板上生长较缓慢的即为His+Muts表型菌株。

1.8 目的蛋白的诱导表达

选取PCR鉴定正确的重组菌接种至含10 mL YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）的试管中，30℃、200 r/min振荡培养过夜；次日以1%的比例（V∶V）接种至含100mLBMGY培养基（1.34%YNB、4×10-7生物素、10%甘油、1% 酵母提取物、2%蛋白胨、5%甘油）的500 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振荡培养约24 h；离心并将菌体重悬于 BMMY 培养基（1.34%YNB、4×10-7生物素、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇）中，28℃，200 r/min振荡诱导表达4 d，每隔24 h补加100%甲醇至终浓度为0.5%，按时间段取样进行分析。

1.9 外源基因表达产物的SDS-PAGE分析

将工程酵母菌在BMMY培养基中诱导培养一定时间后，离心分别收集沉淀和上清，并将培养上清用硫酸铵沉淀法初步纯化，用2倍上样缓冲液与沉淀和纯化的上清蛋白等量混合进行SDS-PAGE试验以分析目的蛋白的表达。

1.10 蛋白印迹（Western-blot）检测

将SDS-PAGE的电泳产物转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂乳封闭。分别用CSFV阳性猪血清、原核表达Erns蛋白单抗作为一抗，进行Western-blot检测。

2 结果与分析

2.1 Erns基因扩增产物的鉴定

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到约681 bp左右的条带（图1）。

图1 PCR扩增Erns基因

2.2 pPIC9K-Erns阳性重组质粒的筛选

将双酶切后的目的片段和表达载体片段连接后转化E.coli JM109，在含有AMP+的LB平板上随机挑取5个菌落直接进行PCR，电泳显示菌落2、4、5、6有与目的基因相符的条带，1为阴性对照，说明 2、4、5、6 可能为阳性重组子（图 2）。

图2 重组质粒特异性引物PCR鉴定

选两个提取质粒进行双酶切鉴定，电泳结果显示2有两个条带，其一为载体片段（约9 kp左右），其二为与目的基因相符的条带（681 bp），而1则为假阳性质粒（图3），将构建好的重组质粒送上海生工生物制品公司测序，结果证明Erns基因已正确插入pPIC9 K的多克隆位点上。

图3 重组质粒双酶切鉴定

2.3 pPIC9K-Erns重组酵母菌株的筛选及PCR鉴定

DNA测序结果显示，重组质粒pPIC9K-Erns序列和读码框架皆正确。pPIC9K-Erns经SalⅠ酶切线性化后，转化Pichia p astoris GS115酵母感受态细胞，在MD平板上长出19个His+转化子，小量培养后，提取基因组DNA，同时提取空白对照GS115 的基因组，作为模板，以 5′AOX1 和 3′AOX1为引物进行PCR，电泳检测在1 173 bp左右有条带出现，与 Erns基因（681 bp）加载体序列（492 bp）的大小（1 173 bp）相当，同时以设计的其自身引物Erns 5′和Erns 3′为引物，得到与目的基因相符条带（681 bp），表明pPIC9K-Erns已整合进酵母染色体中。对阳性菌株用MM和MD培养基鉴定其表型，结果均为 His+Mut＋。

图4 重组酵母的PCR鉴定

2.4 Erns基因表达产物的SDS-PAGE分析及Western-blot检测

将筛选的转化子分别接种BMGY和BMMY培养基诱导表达后，将表达上清透析、浓缩后进行SDS-PA GE。结果显示，GS115/p PIC9K-Erns转化子3和4的诱导产物在50 kD处出现与预计的以同源二聚体形式存在的Erns大小相符的条带（见图5），而1和2及阴性对照5则没有这一条带。

图5 表达产物的SDS-PAGE电泳及Western-blot分析

Western-blot结果显示（见图5），重组蛋白Erns可被CSFV多抗血清识别（第6条带），而阴性对照则不显色（第7条带）。证明本试验所得的表达产物可检测CSFV的抗体。

3 讨 论

表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要工具，要求其经济、高效，并且安全。巴斯德毕赤酵母（Picha pastoris）作为甲醇营养型酵母的一种，能够在以甲醇作为单一碳源的培养基上生长，既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作的特点，又具有真核生物的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰的优点，同时其遗传比较稳定、能够高密度发酵、蛋白的表达量高、且易于纯化，因此，毕赤酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的宿主[9-10]。目前已有400多种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中成功表达[11-12]，该系统是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。

猪瘟病毒的结构蛋白为C和包膜糖蛋白Erns、E1、E2。除Erns、E2蛋白外，猪瘟的其他任何结构蛋白均不能产生中和抗体[13]。Erns由227个氨基酸残基（Glu268-Ala494）组成，以分子质量为97 ku的同源二聚体存在。Erns可诱导产生猪瘟的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫[14]。此外，编码Erns的核酸比E2保守性更高，因而其不仅可作为防控猪瘟的一种靶蛋白，也可配合E2亚单位疫苗免疫的检测来区分自然感染或人工免疫，开发应用前景比较好。余兴龙等用大肠埃希菌表达的CSFV重组E2蛋白为抗原，建立了检测CSFV抗体的间接EL ISA方法[15]。韩雪清、满朝来等人均建立了E2蛋白的酵母表达株，获得了比较大的表达产量，并对其表达条件进行了优化[16-17]。Erns目前的表达均集中于原核，其表达量较小，且不能进行后加工，难以进行进一步分析。

本研究通过构建重组质粒pPIC9K-Erns，成功转化和筛选到两株多拷贝的工程酵母菌株，通过甲醇诱导培养分泌表达的Erns蛋白量很高，并且pPIC9K载体表达蛋白带有His标签，为后期的亲和层析纯化蛋白创造了有利条件。Western-blot分析结果表明，表达的Erns蛋白能识别天然猪瘟多克隆抗体，具有生物学活性，下一步试验将大量诱导表达Erns蛋白，收集表达产物，经过变性、复性和纯化，以期得到高产量的纯化Erns蛋白，进一步研究Erns蛋白的功能与结构。

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