施春阳,齐香君
(陕西科技大学生命科学与工程学院, 陕西 西安 710021)
黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.)的根,主产于我国北方,最主要的有效成分为黄芩苷,具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎、抗肿瘤等药理作用[1,2],在中药制剂中应用广泛.
黄芩苷的提取方法研究较多,主要有煎煮法、碱提酸沉法、微波提取法和超声提取法等[3-5],提取率一般在10%左右,但是粗品中黄芩苷含量较低,特别水提时水溶性杂质过多,增加后期过滤和提纯的困难.黄芩苷弱酸性,PKa值5.047,强碱时极不稳定,弱酸下稳定,油/水分配系数随pH增大而降低,20 ℃时在水和乙醇中的溶解度分别为160 μg/mL和1 458 μg/mL[6,7].
本课题基于黄芩各成分PKa值的不同,采用乙醇超声提取,通过调节提取介质pH值,使黄芩苷游离而增加乙醇中溶解度,使其他成分成盐而降低溶解性,并减少水溶性杂质引入,来提高黄芩苷提取率,同时增加了粗品中黄芩苷的含量,简化了黄芩苷的提取和纯化工艺,得到了较好的效果.
1.1.1 试验材料
黄芩,购于民生大药房;黄芩苷对照品,中国药品生物制品检定所(715-200111);其他试剂均为分析纯.
1.1.2 主要仪器
752型紫外可见分光光度计: 上海光谱仪器有限公司;KQ-500DE数控超声仪: 昆山市超声仪器有限公司; RE-52旋转蒸发器: 上海亚荣生化仪器厂;TDL-5A-B台式低速离心机:湖南星科科学仪器有限公司.
1.2.1 标准曲线制作
甲醇溶解黄芩苷对照品,紫外扫描仪中慢速扫描,选择合适λ为含量测定波长.
精密称黄芩苷对照品2.5 mg,甲醇定容至50 mL,分别精密取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL和6.0 mL,标准液于10 mL容量瓶,甲醇定容,采用752型紫外分光光度计于波长λ处测吸光度A.C(μg/mL)对A作图,计算标准曲线回归方程.
1.2.2 样品含量测定
精密称待测样品3.0 mg,甲醇定容至50 mL,精密移取3.0 mL于10 mL容量瓶,甲醇定容,紫外分光光度计中于λmax处测吸光度A,根据回归方程计算C(μg/mL),按下式计算含量:
本工艺以酸性乙醇溶液为介质超声法提取,基本操作:黄芩粗粉(40目),一定pH和浓度的乙醇液、一定温度和超声功率下提取相应时间,合并滤液,旋转蒸发至1/3,调pH值至2.0,80 ℃保温静置4 h,离心,2倍乙醇、1倍水洗涤,60 ℃干燥5 h,得粗品,精密称重.
影响提取效率的因素主要为乙醇浓度(体积比)、提取液pH值、超声功率、温度和提取时间等,以M(黄芩苷粗品质量×黄芩苷含量)为指标,对各因素进行单因素试验,并通过正交试验优化.
经紫外线扫描,最佳检测波长定为278 nm,黄芩苷标准曲线回归方程为:A=0.072 7C+0.049 1,r=0.999 1,n=6,甲醇,可见黄芩苷在5~35 μg/mL时本测定方法线性关系良好.
2.2.1 乙醇浓度对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,选不同浓度乙醇溶液,调pH至4.0,料液比1∶15,70 ℃、24 kHz下超声1.5 h,其余按基本操作进行,结果如图1所示.
图1 乙醇浓度对黄芩苷提取效果的影响 图2 乙醇液pH值对黄芩苷提取效果的影响
由图1可知,粗品中黄芩苷含量随醇浓度的增加而增加,且浓度越高含量增加幅度越小.综合考虑M值,醇浓度60%时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
2.2.2 乙醇液pH值对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,60%乙醇液,调pH至不同值,料液比1∶15,70 ℃、24 kHz超声下1.5 h,其余按基本操作进行,结果如图2所示.由图2可知,粗品中黄芩苷含量随乙醇溶液pH值的增加先增加后下降.综合考虑M值,乙醇溶液pH值为4.0时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
2.2.3 超声功率对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,60%乙醇液,调pH至4.0,选不同超声功率,料液比1∶15,70 ℃下超声1.5 h,其余按基本操作进行,结果如图3所示.
由图3可知,超声功率对粗品中黄芩苷含量的影响不大.综合考虑M值,超声功率为32 kHz时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
图3 超声功率对黄芩苷提取效果的影响 图4 提取温度对黄芩苷提取效果的影响
2.2.4 提取温度对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,60%乙醇液,调pH至4.0,料液比1∶15,选不同提取温度,于32 kHz下超声1.5 h,其余按基本操作进行,结果如图4所示.
由图4可知,超声温度对粗品中黄芩苷含量的影响不大.综合考虑M值,超声温度为60 ℃时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
2.2.5 料液比对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,60%乙醇液,调pH至4.0,选不同料液比,60 ℃、32 kHz下超声1.5 h,其余按基本操作进行,结果如图5所示.
由图5可知,粗品中黄芩苷含量随料液比的增加而缓慢下降.综合考虑M值,料液比为1∶15时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
2.2.6 提取时间对黄芩苷提取效果的影响
称黄芩粗粉20.000 g,60%乙醇液,调pH至4.0,料液比1∶15,70 ℃、32 kHz下超声提取不同时间,其余按基本操作进行,结果如图6所示.
由图6可知,粗品中黄芩苷含量随提取时间的延长略有下降,但影响不显著.综合考虑M值,提取时间为2 h时,黄芩苷的提取率最高,效果最好.
图5 料液比对黄芩苷提取效果的影响 图6 提取时间对黄芩苷提取效果的影响
根据单因素试验结果,确定影响黄芩苷提取的较明显的4个因素:乙醇液浓度、提取温度、料液比、超声功率,分别选取3个水平,因素水平如表1所示.采用正交表L9(43)进行正交试验,结果如表2所示.
表1 正交试验因素水平表
由表2可知,A、C因素显著,B、D为不显著因素,各因素对试验指标影响的主次顺序为:CADB,并由R值分析可得,最优水平组合为:C3A2D1B2,且与试验5吻合,黄芩苷提取率达11.84%.
表2 正交试验结果与分析表
黄芩苷的酸醇超声法提取优化工艺为:黄芩粗粉(约40目)加pH 4.0的60%乙醇液18倍量,60 ℃、32 kHz超声提取2 h,合并滤液,旋转蒸发至1/3,浓缩液调pH值至2.0,80 ℃保温静置4 h,离心,用2倍乙醇、1倍水洗涤,60 ℃干燥5 h得粗品,黄芩苷提取率达10%以上,含量85%以上.
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