培哚普利对心肌缺血再灌注损伤早期Toll样受体4表达的影响

郭文超,牛 凡,路映攀

近年有研究表明某些炎性细胞因子,如C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等介导的炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用[1]。Toll样受体4蛋白(Toll like receptor 4,TLR4)是新近发现的天然免疫中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体。有资料显示,TLR4信号传导缺陷可明显减轻缺血再灌注期间与心肌损伤加重相关的炎症反应,提示TLR4可能介导了心肌缺血再灌注损伤的炎症反应[2]。本实验应用大鼠心肌缺血再灌注模型,观察培哚普利对缺血再灌注心肌细胞Toll样受体4蛋白的影响,并探讨培哚普利对心肌缺血再灌注损伤可能的保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物及其分组 健康成年W istar大鼠(清洁级,山西医科大学生理实验中心提供)30只,体重220 g～300 g,雌雄不限,随机分为假手术组、缺血再灌注组和培哚普利组,每组10只。培哚普利组灌服培哚普利4mg/kg,每日1次,共7 d,假手术组及缺血再灌注组灌服等量生理盐水,每日1次,共7 d。

1.2 药品与试剂 TUNEL试剂盒,TLR4蛋白一抗为兔抗大鼠多克隆抗体(美国Oncogene公司),二抗为人抗兔S-P试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。培哚普利片(施维雅,天津制药有限公司生产),肝素注射液(北京双鹤药业股份有限公司生产)。

1.3 动物模型的制作 乌拉坦5 m L/kg腹腔注射麻醉,气管插管进行呼吸机辅助呼吸(HX200动物呼吸机,成都泰盟科技有限公司),呼吸频率50/m in,潮气量20m L/kg,四肢皮下插入针形电极描记心电图,沿胸骨左缘开胸,于第3、4肋间行纵向切口,剪断肋骨,破胸膜,心包膜,在左冠状动脉前降支起始部,用6～0丝线穿过心肌浅层,将丝线两端一起穿入直径为1 mm的聚乙烯管中,稳定1 m in后抽紧线,将聚乙烯管压向冠状动脉并与丝线一并夹住,阻断冠脉血流,造成心肌缺血。45 m in后放松聚乙烯管和丝线,以造成再灌注损伤模型。以心电图ST段抬高,局部心肌出现发绀为缺血形成,以心电图ST段降低,宽大畸形Q波出现作为模型复制成功的标准。再灌注1 h后处死动物,取缺血区心肌组织,10%中性甲醛4℃固定24 h,常规脱水,石蜡包埋,切成厚5μm切片备用。假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线,不结扎,余步骤同上。

1.4 测定指标

1.4.1 光镜观察切片 切片行HE染色,光镜下观察心肌组织毛细血管腔和管壁的变化,以及心肌细胞与间质的形态学改变。

1.4.2 细胞凋亡指数 切片常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇入水后,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法原位标记心肌凋亡细胞核。每一组均设阴性对照,用PBS液代替一抗作为阴性对照,正常细胞核呈蓝色,而凋亡细胞核呈棕黄色。在光学显微镜下计数5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的比例,计算心肌细胞凋亡指数。

1.4.3 TLR4蛋白平均积分光密度 切片经苯和梯度乙醇脱蜡,于3%的过氧化氢甲醇溶液中浸泡30 m in,在二胺四乙酸(0.01 mol/L,pH 8.0)中加热20 m in,经PBS漂洗3次后,于正常山羊血清中孵育10m in。一抗为兔抗大鼠TLR4蛋白多克隆抗体,二抗为抗兔S-P试剂盒。经二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素衬染、透明、脱水、封片。以PBS替代一抗作为阴性对照。细胞质显示棕黄色为TLR4蛋白表达阳性。显微图像采集系统对每张免疫组化切片随机选取5个高倍视野(×400),利用Image.Pro Plus 5.0专业图像分析软件分析阳性的平均灰度值(0～255范围内,灰度值与染色强度成反比),求出平均积分光密度(averageintegrate op tica l density,A IOD)。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准差(±s)表示,组间差异采用单因素方差分析,P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理组织学变化 缺血再灌注组心肌微血管内皮细胞损伤,心肌细胞变性,可见小灶性坏死。心肌间质小灶性出血,炎细胞呈小片状浸润,肌浆内形成收缩带。培哚普利组心肌间质轻度水肿,肌浆凝聚,少数炎细胞浸润,肌浆内形成收缩带,心肌间质少数红细胞浸润,损伤较缺血-再灌注组明显减轻。假手术组心肌微血管内皮细胞心肌细胞未见明显损伤。

2.2 心肌细胞凋亡指数 心肌细胞凋亡指数培哚普利组为(7.2±2.4)%,假手术组为(1.6±0.4)%,缺血再灌注组为(10.5±3.9)%,培哚普利组较缺血再灌注组低(P＜0.05),但高于假手术组(P＜0.05)。

2.3 TLR4蛋白平均积分光密度 AIOD培哚普利组为8.47±2.96,缺血再灌注组为13.75±2.59,假手术组为2.48±1.15,培哚普利组较缺血再灌注组低(P＜0.05),但高于假手术组(P＜0.05)。

3 讨 论

目前,缺血再灌注损伤发生的机制尚未完全阐明,氧自由基生成、钙超载和白细胞激活可能是其发生的主要机制[3]。心肌缺血再灌注会导致强烈的炎症反应,其已成为心肌缺血再灌注损伤的特征,包括活性氧的产生、补体的激活及多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)的浸润等[4],而PMN的浸润是心肌缺血再灌注后的主要问题。缺血再灌注损伤通过细胞因子、中性粒细胞、巨噬细胞和氧自由基诱导的急性炎症反应使得心肌细胞凋亡明显增加[5]。国内亦有研究显示,TLR4在正常及缺血的心肌细胞中均有表达,心肌缺血恢复血液灌注后,TLR4的表达迅速上调,再灌注1 h达到峰值,TLR4可能通过促进炎性因子如TNF-α的产生分泌增多来介导心肌的炎性损伤[6]。

本实验结果显示,心肌缺血再灌注使心肌炎症反应剧烈,光镜下见到血管壁中性粒细胞大量浸润,心肌纤维肿胀,从而支持炎症反应参与心肌缺血再灌注损伤。经培哚普利处理后的心肌炎症反应明显减轻,表明培哚普利对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与抑制炎症反应有关。近来研究表明培哚普利等血管紧张素转换酶抑制剂能抑制循环和组织中血管紧张素转换酶(ACE),减少血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的形成,并作用于激肽酶Ⅱ,抑制缓激肽的降解,提高缓激肽水平,起到改善内皮功能,抑制炎症反应,拮抗心肌缺血再灌注损伤[7,8]。本研究亦显示培哚普利可减少在体大鼠心肌缺血再灌注60 m in时心肌细胞凋亡指数,抑制AngⅡ,从而通过减少Toll样受体4蛋白而减轻IL-6、TNF-α等表达,减轻炎症反应,保护缺血再灌注心肌。但其具体机制有待进一步研究,对TLR4介导的信号通路的进一步研究将为缺血再灌注损伤的防治提供新的靶点。

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