衰老大鼠心肌组织中活性氮簇的改变及可能意义1)

田 珏,李晓宇,张苏丽,杜芸辉,王 可,刘慧荣

心脏组织凋亡增加是衰老心脏心功能降低,并对损伤刺激(如心肌缺血再灌注)的易感性增加的主要原因之一[1,2],但凋亡增加的机制不完全清楚。近年来研究表明,源于一氧化氮(NO)的活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)是细胞损伤的重要介质,RNS具有促凋亡和抗凋亡的双重作用,普遍认为低浓度NO具有细胞保护作用;高浓度的NO及其与超氧化物的双自由基反应产物过氧亚硝基(ONOO-)具有细胞毒性[3-6]。衰老心脏NO含量较成年增高[7],但这种增高的病理生理意义并不清楚,特别是NO的这种增高是否能导致衰老的心肌组织中ONOO-增高,进而使衰老的心脏凋亡增加则有待进一步研究。本研究探讨了衰老心脏活性氮簇的改变及其与衰老心脏凋亡增加的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠,成年大鼠(4～6)月龄,衰老大鼠(22～24)月龄,购自四川省医学科学院实验动物研究所。

1.2 心肌组织Caspase-3活性分析 取心肌组织样品,每1 mg组织加入裂解液 10 μ L,置冰上剪碎,匀浆,离心。取上清,一部分用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度;一部分测定Caspase-3活性。取30μ L上清,65 μ L 反应缓冲液,5μ L底物(DEVD-pNA)加至96孔ELISA板中;背景对照孔除不加底物外,余同实验孔,用反应液将每孔的液体补齐至100μ L。37℃水浴1.5 h后,用酶标仪测定光密度值。结果以比活性反应心肌组织中Caspase-3的活性。

1.3 Western-blot测定VASP和p-VASP的蛋白表达 称取心肌组织的重量,按照1 mg组织加入10μL裂解液的比例制备组织匀浆,提取上清,利用SDS-PAGE电泳技术分离匀浆组织中的蛋白,再转移至硝酸纤维素膜,用VASP、pVASP单克隆抗体(A.G.Scientific,Inc),免疫印迹检测心肌组织VASP、pVASP含量。

1.4 双抗体夹心ELISA法检测心肌组织硝基酪氨酸含量BCA法检测蛋白浓度。将抗硝基酪氨酸单克隆抗体(Upstate Biotechnology)以每孔100 μ L加入酶标板,4°C孵育过夜,次日弃去上清。将 5%BSA-PBS加入 ELISA板,每孔 100 μ L,37℃孵育2 h后弃去上清。将不同浓度的硝基酪氨酸标准品及心肌组织样品上清分别加入酶标板,将兔源性抗硝基酪氨酸多克隆IgG抗体(Upstate Biotechnology)加入酶标板,加入标记有辣根过氧化物酶标记的二抗,使用酶标仪在波长490 nm处测定光密度(OD)值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。以均数±标准差(±s)表示,两样本均数组间比较采用t检验,两个连续型随机变量间的关联性采用线性相关分析。

2 结 果

2.1 衰老大鼠心肌组织Caspase-3比活性 与成年大鼠(1.000±0.028)相比,衰老大鼠Caspase-3的比活性为(2.210±0.327,P＜0.01),显著增高。

2.2 衰老大鼠心肌组织pVASP蛋白表达 衰老大鼠心肌组织中的总VASP蛋白表达与成年大鼠相接近,但pVASP蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)。

2.3 衰老大鼠心肌组织硝基酪氨酸含量 与成年大鼠的心肌组织硝基酪氨酸(0.858±0.143)ng/mL相比,衰老大鼠的硝基酪氨酸含量明显升高(1.545±0.194)ng/mL(P＜0.05),说明衰老大鼠心肌组织中有大量过氧亚硝基产生。

2.4 心肌组织硝基酪氨酸含量与Caspase-3活性相关性分析大鼠心肌组织硝基酪氨酸含量与Caspase-3活性呈正相关(r=0.749,P＜0.01),即随着硝基酪氨酸含量增高,Caspase-3活性相应增加。衰老大鼠心肌组织凋亡的增加可能与其硝基酪氨酸含量增高有关。

3 讨 论

本研究结果显示衰老大鼠凋亡明显增加,心肌组织中的总VASP与成年大鼠相接近,但pVASP水平明显降低。衰老大鼠心肌组织中硝基酪氨酸较成年大鼠明显升高,相关性分析显示大鼠心肌组织硝基酪氨酸含量与Caspase-3活性呈正相关。

大量资料提示衰老心脏对疾病的易感性增加。这可能与衰老心脏心肌细胞凋亡增加有关。因为心肌细胞是终末分化细胞,凋亡的增加必然使心肌细胞减少而减弱心脏的泵功能,引起电传导不均一,而发生心律失常以及使周围心肌细胞重排导致心肌重构等从而引起广泛的机械、电活动障碍。研究发现,人类和动物衰老过程中出现大量心肌细胞丢失[8];70岁健康男性仅由衰老导致的心肌细胞丢失就占左右心室细胞总数的30%[9]。Kajstura等[10]发现,在衰老大鼠中,凋亡比坏死更为普遍。但衰老心肌组织凋亡增加的机制不完全清楚。衰老心脏NO含量较成年增高,而且高浓度的NO及其与超氧化物的双自由基反应产物过氧亚硝基具有细胞毒性,其与衰老心肌凋亡增加是否有关有待研究。如能揭示衰老时心肌细胞凋亡增加的潜在机制,或许可为扭转这种细胞丢失提供指导。

VASP由 Halbrugge和Walter首次提出[11],它是血小板中一种主要的磷酸化蛋白质。最近的研究表明:VASP是cAM P和cGMP依赖性蛋白激酶下游的靶物质,磷酸化VASP(pVASP)的表达量可用于监测 NO/cGM P信号通路[12,13]。pVASP降低表明NO的生物利用度降低,提示还存在其他化学或生化反应与正常NO/cGMP活化通路相竞争。目前已明确的能与 cGMP竞争NO的分子是˙O2-,˙O2-可与NO生成具有细胞毒性的ONOO-,因此比较衰老与成年大鼠心肌中的ONOO-水平。ONOO-极不稳定,很容易降解,因此无法直接检测其含量。组织硝基酪氨酸形成是体内ONOO-形成的印迹和标志,其含量可以直接反映ONOO-的水平,衰老大鼠心脏硝基酪氨酸明显增高,而相关性分析表明心肌组织中ONOO-的含量与细胞凋亡率呈正相关。

本实验观察到,衰老心肌组织NO生物利用度明显降低,衰老心脏中增加的NO大多生成为具有细胞毒性的ONOO-,毒性的ONOO-使得衰老心脏凋亡增加。提示或许可通过使用ONOO-解毒剂来减少衰老心肌的凋亡,而衰老心脏ONOO-升高的机制则有待进一步研究。

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