多药耐药相关蛋白-3表达与肝癌耐药的相关性

郭晓林 姜雅秋 金清龙

(吉林大学第一医院,吉林 长春 130021)

肿瘤细胞多药耐药产生的分子机制非常复杂,在所有耐药机制中,被认为是最主要的也是人们研究最多就是 ABC结合核膜转运蛋白,如P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白 1(MRP-1)及乳腺癌耐药蛋白;而最近又发现几个多药耐药相关蛋白的新成员-多药耐药相关蛋白-2(MRP-2)、MRP-3、MRP-5〔1～4〕,为探讨MRP-3与肝癌耐药的相关性,我们从分子水平研究MRP-3在肝癌耐药细胞株 HepG2/ADM与肝癌细胞株和正常肝细胞株中的差异表达情况,为肝癌的多药耐药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及来源 人肝脏细胞系 L-02和肝癌细胞系 BEL购自中国科学院上海细胞生物学研究所。人肝癌耐药细胞Hep G2/ADM购于广州市达晖生物技术有限公司。

1.2 主要试剂、材料与仪器 阿霉素标准品、MTT均购自Sigma公司,RNA提取试剂盒、Trizol试剂及逆转录酶 M-MLV均为为 Invitrogen产品;DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品;显色试剂盒ECL Western印迹试剂为 Amersham产品。Microplate Reader450酶标仪;GeneAmp PCR System 2400型 PCR扩增仪;EPICS型流式细胞仪;AlphaEaseFC凝胶成像系统。

1.3 RT-PCR法检测 MRP3mRNA的表达 采用Trizol一步法提取细胞总RNA,M-MLV逆转录酶进行逆转录及PCR扩增,合成 cDNA。以 β-actin作为内参照。PCR引物序列为 MRP3(107 bp):上游 5′-CTTAAGACTTCCCCTCAACATGC-3′,下游 5′-GGTCAAGTTCCTCTTGGCTCA-3′;β-actin(214 bp):上游 5′GTGGGGCGC CCCAGACACCA 3′, 下 游 5′CTCCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′;扩增条件为:94℃预变性 5min,94℃30s,55℃30 s,72℃1 min,25个循环,72℃延伸 7 min。 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,在多向分析凝胶成像系统中观察。

1.4 MRP-3寡核苷酸的转染 参照脂质体说明书进行转染。HepG2/ADM细胞消化后计数,分别接种于 6孔细胞贴壁,更换无血清培养基。实验分反义组、正义组、空脂质体组及对照组。每组设 3个复孔,实验重复 3次。具体步骤按说明书操作。全硫代磷酸修饰的正、反义寡核苷酸(22 bp):MRP-3正义链:5′-GATCCGAGTAAGACCATTCAGGTCTTCAAGAGAGAGACCTGAAT GGTCTTACTCTTTTTTA-3′;反 义 链:5′-AGCTTAAAAAAGAGTAAGACCATTCAGGTCTCTCTTGAAGACCTGAATGGTCTTACTCG-3′。

1.5 胞内 ADM浓度的测定 取转染前及转染 24 h后Hep G2/ADM细胞,胰酶消化,调整细胞密度为 5×105/ml,细胞贴壁后加入 ADM 1μmol/L,37℃作用 30 min,冷 PBS洗 1次,更换无药培养基继续培养 30 min后收获细胞,采用 FCM检测胞内 ADM的荧光强度。

1.6 转染后MRP-3 mRNA的表达 半定量RT-PCR法测定。收集 6孔板中转染 24h的各组细胞,行PCR扩增,PCR产物经电泳后在多向分析凝胶成像系统中扫描并分析、计算 MRP-3基因的相对表达值。实验重复 3次。

1.7 转染前后细胞内ADM耐药指数 细胞转染 24 h后,在96孔板中分别加入 6个不同浓度的 ADM,设 5个复孔,对照组加生理盐水,继续培养 48 h,吸出培养基,每孔加入 5 mg/ml MTT 10μl,37℃ 4 h。每孔加入 200μl二甲亚砜,避光振荡混匀,全自动酶标仪测定 620nm波长的吸光度值(A),细胞相对存活率 =(实验组 A/对照组 A)×100%,作图得 IC50,计算耐药指数(RI),RI=耐药细胞 IC50/亲代细胞 IC50。

2 结 果

2.1 MRP-3 mRNA在各细胞系中的表达 MRP-3mRNA在L-02中表达量为 4 620±362,在 BEL中表达量为 7 871±386,此两组 MRP-3mRNA表达量明显低于 HepG2/ADM中的表达量(9 802±373)(P均 ＜0.05)。

2.2 Hep G2/ADM细胞内 ADM荧光强度检测 转染前Hep G2/ADM细胞内 ADM的荧光强度为 6.94±0.57,单纯转染空脂质体及正义链后,其内 ADM的荧光强度分别为 6.25±0.55和 6.59±0.45,较转染前无明显改变(P＞0.05)。转染反义链后,其内ADM的荧光强度分别为 9.68±0.58,较转染前明显增加(P＜0.05)。

2.3 转染前后 HepG2/ADM细胞 ADM耐药指数 转染前Hep G2/ADM细胞的ADM耐药指数为 18.56,转染空脂质体和正义链的 HepG2/ADM细胞的 ADM耐药指数分别为 17.78和16.89,与转染前的耐药指数无明显差异,而转染反义链的Hep G2/ADM细胞ADM耐药指数为 5.56,较转染前明显下降(P＜0.05)。

2.4 转染前后Hep G2/ADM细胞MRP-3 mRNA的表达 单纯转染空脂质体及正义链的 HepG2/ADM细胞 MRP-3 mRNA的表达分别为 89.67±4.28和 85.34±4.56,与转染前(86.87±4.67)无明显降低,而转染反义链后,HepG2/ADM细胞MRP-3 mRNA的表达(32.58±3.75)较转染前明显降低了 62.5%(P＜0.05)。

3 讨 论

肿瘤耐药的本质是肿瘤细胞在生存压力下建立起来的一种适应过程,其产生和维持有其复杂的分子网络。因此,从基因表达水平寻找在耐药产生中具有关键作用的分子改变,对于全面了解耐药机制从而逆转耐药具有重要的意义。MRP-3是多药耐药蛋白家族的成员之一,属 ATP膜转运蛋白,在氨基酸序列上与 MRP-1有 58%同源性,编码分子量为 190 kD的糖蛋白,在肝、十二指肠、结肠、肾上腺及胰腺中呈高表达。作为胞浆膜流出泵,在VP16的流出、活性及敏感性方面起关键作用,参与了 VP16、MTX、DDP、DOX的耐药,而反义 MRP-3 cDNA能改变 VP16、DDP等药物的敏感性〔5～7〕。

本研究采用 RT-PCR方法检测了正常肝细胞,肝癌细胞及肝癌耐药细胞中MRP-3的表达情况,结果表明肝癌耐药细胞中的MRP-3 mRNA的表达量明显高于正常肝细胞和肝癌细胞。故此我们推测 MRP-3可能参与了肝癌的耐药,这与 Leah等〔8〕报道的MRP-3参与非小细胞肺癌的耐药机制具有一定的相似性。

反义治疗是基因治疗的重要组成部分,其阻断作用主要在翻译过程,而翻译起始位点附近的核苷酸常常是决定翻译的关键因子,因此与mRNA起始编码区的结合可能起最有效的阻断作用。根据这一原则及 MRP-3 cDNA序列,设计并人工合成了包含 MRP-3 mRNA翻译起始位点 ATG的寡脱氧核苷酸,通过阳离子脂质体载体,将 MRP-3片段转染进高表达 MRP3的Hep G2/ADM细胞后,MRP-3mRNA表达显著下降,胞内药物浓度显著上升,对阿霉素的敏感性得到恢复;而转染正义寡核苷酸或脂质体的耐药株上述指标无显著变化。进一步证实肝癌细胞株的耐药主要是由于 MRP-3的过表达导致胞内药物浓度降低所产生;而MRP-3的反义寡核苷酸可抑制其表达。

本研究结果表明,肝癌耐药细胞株中 MRP-3的表达明显增加,而用反义链MRP-3 cDNA可使表达MRP-3的细胞株恢复对阿霉素的敏感性,所以 MRP-3的表达对肝癌细胞的化疗药物耐药有着极大的关系,且针对 MRP-3基因表达的干扰能有效地逆转肝癌细胞的多药耐药,增强了肝癌细胞对化疗药物的敏感性,这在肿瘤的基因治疗方面也显示了可观前景。

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