干扰素脂质体的制备与质量控制

曾德贵，曾洪辉

(1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020;2.广东省药物研究所，广东 广州 510440)

干扰素作为细胞因子常被用来治疗多种疾病，但其血浆半衰期极短，且副作用大。干扰素为一种活性蛋白质，在体内易被各种蛋白酶降解或作为抗原被免疫系统排除，因此常规的全身或局部给药方式难以使干扰素在病变部位达到较高浓度，药物的利用度很低。应用脂质体包裹干扰素能显著改善其体内的药代动力学，提供靶向定位给药，从而增加干扰素的应用范围[1]，提高药物稳定性，并大幅度降低干扰素的毒副作用。为此，笔者制备了干扰素脂质体，并对其处方、工艺制备、粒径、包封率等进行研究，还建立了质控体系，报道如下。

1 仪器与试药

细胞培养设备;722型分光光度计(上海第三分析仪器厂);SB3200型旋转蒸发器(上海医械专机厂);超速离心机(美国Beckman);CK2型倒置光学显微镜(日本Olympus);H600-4型电子显微镜(日本Nikon);AS3120型超声波仪(天津奥特赛恩斯仪器公司)。色谱用CM-葡聚糖凝胶、乙二醇单甲醚(试剂级);冻干精制人白细胞干扰素(100万U/支，哈药集团生物工程有限公司);BR生物试剂脱氧胆酸钠(北京市海淀区微生物培养基制品厂);卵磷脂、胆固醇(Sigma产品);IMDM培养基(Gibco产品);胰酶(Difco产品);L929细胞(天津医学院提供);滤泡性口炎病毒(VSV军事医学科学院干扰素组提供)。

2 方法与结果

2.1 处方与制备

处方:卵磷脂40 mg，胆固醇20 mg，氯仿4 mL，乙醚4 mL，磷酸盐缓冲液(pH=7.4)0.5 mL，干扰素-α 100万U。

制备:取卵磷脂40 mg、胆固醇20 mg，溶于氯仿4 mL，于40℃水浴中，以100～150 r/min转速蒸发后，加入乙醚4 mL，并将干扰素-α 100万U溶于0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中并与之混合，二者经超声处理后进行乳化，然后于40℃水浴中以100～150 r/min转速减压，除去有机溶剂即可形成α-干扰素脂质体，最后再通过凝胶柱层析方法除去未包入的药物，得到不含游离的α-干扰素脂质体。

2.2 质量控制

2.2.1 外观形态

在干扰素脂质体制备的过程中，利用光学显微镜对粗制脂质体进行观察，脂质体呈圆形颗粒状，大小比较均匀。制备的脂质体成品经负染色后进行电镜观察，其背景为黑色，干扰素脂质体为白色圆球颗粒，表面光滑、规整，分散性良好。

2.2.2 粒径测定

取当日新制备的脂质体干扰素-α，加适量生理盐水稀释，滴在载膜铜网上，4 min后用滤纸吸去多余的水分，然后滴入2%磷钨酸(pH=7.4)，4～5 min后吸去多余的磷钨酸溶液，晾干，于电子显微镜下观察规则圆点，用库尔特粒子分析仪测定粒子大小和分布，经检测，干扰素脂质体粒径为正态分布，脂质体平均粒径为285.6 nm。

2.2.3 包封率测定

微形柱制备:取5 mL注射器筒1个，底部置入一略小于内径的圆形尼龙网，然后加入适量(5 mL)经pH为7.2的磷酸盐缓冲液浸泡的葡聚糖凝胶G-50，将装好的注射器筒放入干燥离心管内，于4℃ 1 500 r/min转速离心5 min，备用。

游离人干扰素-α分离试验:取含100万U游离干扰素-α的液体，加到微型柱顶部，以1 500 r/min转速离心5 min，收集滤液过滤除菌，作为A液备用。

干扰素脂质体中游离干扰素-α分离试验:取相当于100万U干扰素的脂质体干扰素-α，缓缓加入微形柱顶部，收集滤液，加适量0.4%脱氧胆酸钠，温度4℃，3 000 r/min转速离心30 min，取下层液体，过滤除菌，作为B液备用。

测定方法:将A液和B液均配制成1 mL的溶液，并取干扰素-α 100万U溶于1 mL缓冲液中，对此3种溶液采用“细胞病变抑制法”，攻击病毒采用滤泡性口炎病毒，剂量为300 TCID50。采用40孔培养板。倍比稀释待测上清液，每孔加入50 μL，随后各孔加入L929细胞悬液50 μL(内含4×104个L929细胞)。设细胞对照和病毒对照，3个复孔。37℃ CO2孵箱中15 min。染毕，用水洗脱残余染料。每孔加入200 μL，用震荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出。用可测微板的722型分光光度计于540 nm波长处比色。

计算包封率(EE):测得游离干扰素-α效价为997.86 U/mL(n=3)，干扰素-α脂质体经柱分离的游离干扰素-α效价为0，表明该柱能将干扰素完全吸附。将过柱后脂质体干扰素-α处理，测定效价为 633.84 U/mL(n=3)。EE(%)=(C游离-C未被包封)/C游离×100%=633.84/997.86×100%=63.52%。

2.2.4 有机残留量检测

按2005年版《中国药典(二部)》要求，利用气相色谱法测试干扰素脂质体溶液中的二氯甲烷(CH2Cl2)残留量。按外标法计算含量，其结果远低于药典规定的0.06%。

2.2.5 微生物检查

对干扰素-α脂质体及A液、B液进行钴源照射灭菌，剂量为0.39 kGy，照射40 min后，接种血平板经24 h，无细菌生长，延至48 h，均无细菌生长。

2.2.6 样品稳定性考察

将制备好的3批样品分别放置在37℃，25℃，2～8℃不同温度下，分别对其粒径、渗漏率进行测定，不同时刻渗漏率的值为即时包封率与初始时刻包封率的差值。可以观察到，温度越高，脂质体越易渗漏。放置于4℃的3批脂质体，6个月后取样观察，无分层、沉淀及颜色变化，其粒径、包封率和总体活性基本不变。

3 讨论

逆相蒸发法[2]为制备大单层脂质体或数层脂质体较新的方法，特点是可包裹较大的水容积，适合于包裹水溶性药物、大分子生物活性物质，如胰岛素、干扰素等。试验表明，制备中水浴温度及旋转速度是整个制备方法的关键，并可能影响相关各项试验的结果。同时，适当调节磷脂质、有机溶剂、含药缓冲液三者的比例，可获得较高的包封率。包封率是脂质体的一个重要质量控制指标，脂质体包封率的测定方法选用细胞病变抑制法[3]，既可测定包封率，也可测定其生物活性。因为是通过测定包裹的干扰素生物活性来确定包封率大小，故需要选择适当的裂解剂将脂质体裂解，并使干扰素充分释放出来。在裂解剂作用下，裂解剂和磷脂膜的相互作用，使得磷脂双分子层被破坏，磷脂分子分散到溶液中，作用时间越长，裂解越充分。另外，随着裂解剂的浓度增大，脂质体颗粒裂解越来越充分，对干扰素活性的破坏也就有相应增大的趋势，故裂解剂浓度增大至2.0%后，测定的干扰素脂质体活性不再继续增加，甚至有下降趋势。因此，选择合适的裂解剂是客观反映包封率和渗漏率的关键。

温度对脂质体的包裹和裂解也有着重要的影响，在2～8℃条件下，脂质体渗漏率越小，稳定性越好。因为温度越低，磷脂分子在膜中的流动性越小，膜的稳定性就越高，脂质体颗粒间的融合以及破裂程度就越小，脂质体颗粒之间相对稳定性的增强，减小了脂质体粒径增大以及跨度变大的趋势，从而降低了脂质体的渗漏率。另外，有机物残留量的多少，同样可以反映出脂质体制备工艺的好坏。因为干扰素是水溶性的大分子药物，在制备的过程中受有机溶剂的影响而活性降低，所以应尽量控制不必要的有机物残留，以提高脂质体产品的质量和稳定性。

本试验所建立的干扰素脂质体的制备与质控体系能够较好地反映出所制备的样品质量。该方法操作比较简便、易行，可信度高，适用于干扰素脂质体的大生产。

[1]胡大强，陈 雅.干扰素脂质体的研究进展[J].中国药业，2001，10(9):58-59.

[2]陆 彬.药物新剂型与新技术[M].北京:人民卫生出版社，2005:130.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录56.