毛细管电泳技术在药物吸收分析中的应用前景

苏淇，刘晓颖，甘小玲

（重庆医药高等专科学校药理教研室，重庆 400030）

现代经皮吸收制剂或称经皮给药系统（TTS或TDS）是指在皮肤或黏膜表面给药，使药物以恒定速度（或接近恒定速度）通过皮肤各层或黏膜，进入体循环，产生全身或局部治疗作用的新制剂。黏膜给药主要是指药物通过口腔黏膜、眼角膜和结膜及鼻黏膜等吸收而发挥治疗作用的一种给药方式。目前对经皮给药系统的评价方法主要有离体和在体方法。经皮给药系统的药物一般剂量都较小，且不能完全穿透具有多层生物膜结构的皮肤，无论是在离体或者在体研究中，其吸收程度均不高，同时存在众多的干扰物质，难以分离纯化，因而对吸收药物浓度的检测要求较高。近年来，毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术得到飞速发展，在常规药物分析和其他药物研究中发挥着独特的作用，它具有高效、快速、微量、多模式、经济、自动化及洁净等优点[1]。笔者拟就毛细管电泳技术在经皮吸收系统药物吸收分析中的应用前景作一介绍。

1 优点

CE技术的优点可概括为三高二少：高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达10-15～10-13mol，激光诱导荧光检测器则达10-21～10-19mol；高分辨率，其每米理论塔板数几十万，高者可达几百万乃至千万，而高效液相色谱（HPLC）法一般为几千到几万；高速度，最快可在60 s内完成，250 s内分离10种蛋白质，1.7 min分离19种阳离子及3 min内分离30种阴离子；样品少，只需nL（10-9L）级的进样量；成本低，只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的石英毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使CE法成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。由于CE法还是一种正在发展中的技术，有些理论研究和实际应用正在进行与开发。

2 类型

CE可分析的成分小至无机离子，大至生物大分子，如蛋白质、核酸等，可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，CE分析高效、快速、微量。根据其分离样本的原理设计不同，主要分为以下几种类型：毛细管区带电泳（CZE），毛细管等速电泳（CITP），毛细管胶束电动色谱（MECC），毛细管凝胶电泳（CGE），毛细管等电聚焦（CIEF）。

3 基本原理

CE 法选用的毛细管一般内径约 50 μm（20 ～200 μm），外径375 μm，有效长度 50 cm（7 ～100 cm），以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，其结构包括1个高压电源、1根毛细管、1个检测器及2个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。CE所用的大理石英毛细管柱，在pH＞3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动的现象叫电渗，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（E0F）两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。

4 在透皮吸收测定中的应用

4.1 样品收集与处理

若采用离体皮肤对经皮给药系统进行评价，其接受液多为生理盐水，在与皮肤的接触过程中，会有少量皮肤中的杂质溶解其中，对测定造成干扰。若为在体研究，采取的体内样品如不能立即进行分析，则存在样品的保存问题。对于血样，在采血后离心或加适宜的抗凝剂后离心，得到血清或血浆样品，然后置-20℃或以下温度冷冻保存备用；对于尿样应收集一定时间内的总尿量，以避免药物的损失，并置冰箱冷藏或加防腐剂后保存。无论离体或者在体研究，在样品检测前都需进行组分的提取、分离、纯化、富集，去除蛋白等杂质，收集样品以适应检测的需要。对于不同的药物和检测手段，其前处理过程也不一样。

近年来出现了各种在柱预浓缩技术，如场放大、电堆积富集、等速电泳聚焦浓缩、固相预浓缩、膜预浓缩等，大大提高了CE法的检测灵敏度。其中，场放大样品富集（FASS）技术操作方便，灵敏度提高显著，在体内药物分析中应用极为广泛。样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离，从而提高检测灵敏度。毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分：柱上浓缩是不改变毛细管电泳系统时，将大体积样品直接引入分离毛细管，在电泳前采取适当的措施进行浓缩，然后直接进行电泳分离；柱前浓缩是在改变毛细管电泳系统时进行，一般在分离毛细管前增加一段预柱，大体积样品首先被引入预柱中采取适当措施进行浓缩，然后部分或全部被引入分离毛细管柱中进行分离。作为一种主要的分析技术，毛细管电泳的分析对象也开始从以往相对简单的分析体系逐步扩展到生物样品[2]。样品前处理的效率直接影响到整体分析水平，一般来说，CE技术较多配合固相萃取技术（SPE），简单、耗样量少[3]。待测成分的富集是CE样品前处理技术中另一个关键。纳升级进样量需要相应高灵敏度检测技术与之配套。质谱分析技术（MS）是通过对样品离子的质量和强度的测定进行定量和结构分析的一种分析方法，具有分析灵敏度高、速度快等优点。这两种技术的联用（CE/MS）综合二者优点成为分析生物大分子物质的有力工具。最新发展了一系列的预富集方法，如柱上等速电泳富集法、样品堆积技术以及膜富集或固相富集等技术，以增强浓度灵敏度。例如Chiang等[4]对比了两种毛细管电泳富集技术，采用以磷酸、SDS、二乙胺和乙腈溶液进行冲扫（sweeping method）的方法可检测到质量浓度低至0.1 μg/mL的水平，而同时采用阳离子选择性耗尽（cation-selective exhaustive）进样技术和胶束电动色谱冲扫（CSEI.sweep.MEKC）技术，可以使检测限达到1×10-3μg/mL。

4.2 分析方法

经皮给药系统的体内分析法大体分为直接法和间接法。直接法即直接测定经皮给药后的体内药物及代谢物浓度，这对了解药物的体内过程具有直接的意义；间接法主要通过测定标记药物在生物样品的放射活性，间接获得药物在体内的作用过程。如在月桂氮酮的促渗透机制研究中，用14C进行标记，液闪法测定尿样放射活性，得到单剂量和多剂量月桂氮酮的经皮吸收数据[5]。也可通过测定与经皮给药有关的生理反应或引起的其他体内化学物质浓度变化间接获得。如胰岛素的经皮给药系统可通过测定体内血糖浓度变化，间接获得胰岛素在体内的作用过程。

直接分析法包括HPLC法，气相色谱（GC）法，气相色谱-质谱（GC-MS）联用法，液相色谱-质谱（LC-MS）联用法，放射性免疫（RIA）法等。CE法在透皮吸收样品分析中有独特优势，如与色谱手性分离柱相比，CE技术对生物样品中手性药品的分离显得更为经济、方便。但另一方面还需要发展一系列更为有效、简便及耗样量少的方法对生物样品进行前处理，解决基底干扰问题。

刘继勇等[6]在痹痛宁贴剂的制备及体外释放、透皮吸收研究中，采用了高效毛细管电泳（HPCE）技术。使用美国惠普公司的HPCE毛细管电泳仪，二级管阵列检测器，其中石英毛细管柱为50 μm×32 cm，运行缓冲液为50 mmol/mL的pH为6.0的磷酸盐缓冲液（含20%无水乙醇），压力进样（2 kPa×5 s），分离电压8 kV，检测波长200 nm，操作温度30℃。每次进样前依次用0.1 mol/L NaOH冲洗柱1 min，二次蒸馏水冲洗1 min，缓冲液冲洗2 min，在此条件下分离良好。生物碱类药物的碱性强，极性大，采用HPLC分析时，往往色谱柱吸附太强，造成峰形不好，易拖尾。虽然改善流动相介质可取得一定效果，但常用的离子对试剂对色谱柱污染极大，且分析周期长，不适合大量样品的检测。采用HPCE法测定制剂、体外释放液及透皮扩散液中东莨菪碱的含量，分离效果好，可不经富集直接检测，操作简便快速。

蒋孟良等[7]采用HPCE法测定伤痛外搽酊中毒性成分的透皮吸量。石英毛细管为内径50 μm，有效长度50 cm，缓冲液为0.02 mol/L的磷酸盐，pH为7.0，施加电压为20 kV，温度为25℃，检测波长为210 nm，以外标法计算含量。检测灵敏度高，大鼠在体实验中的平均血药浓度为（32.44 ±3.21）ng/mL。

5 展望

目前，国内经皮吸收药物测定研究主要应用HPLC，但其样品预处理费时、费力，平衡时间和分析时间较长，且耗用大量流动相。而CE具有高效、价廉等优点。更适于普及和发展，通过对样品进行浓缩预处理，可提高检测灵敏度。同时CE技术如何与其他方法和技术如HPLC、MS等联合应用，是今后的研究方向和课题。

[1]陈 义.毛细管电泳技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2000：5-7.

[2]闻 俊，陆 峰，殷学平，等.毛细管电泳技术在细胞及细胞组分分析中的应用[J]. 药学学报，2004，39（7）：566-570.

[3]Lin CC，Li YT，Chen SH.Recent progress in pharmacokinetic applications of capillary electrophoresis[J].Electrophoresis，2003，24：4 106-4 115.

[4]Chiang HY，Sheu SJ.Analysis of ephedra-alkaloids using sweeping and cation—selective exhaustive injection and sweeping micellar electrokinetic chromatography methods[J].Electrophoresis，2004，25：670-676.

[5]Wesrer RC，Mclcndres J.Percutaneous absorption of azone following single and multiple doses to human volunteers[J].Pharm Sci，1994，83（2）：124.

[6]刘继勇，顾 清，胡晋红，等.痹痛宁贴剂的制备及体外释放、透皮吸收研究[J]. 中成药，2004，26（6）：437-439.

[7]蒋孟良，董桂兰，易延逵，等.伤痛外搽酊活血祛瘀作用的研究[J].中成药，2000，22（11）：806-808.