单增李斯特菌检测方法研究进展

黄昭华,孙晓盈,高 申,谢 风*

(1.吉林省中医中药科学院,吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033)

单核细胞增生性李斯特菌L.monocytogenes(简称单增李斯特菌)被认为是引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌,是一种短小的革兰阳性无芽胞杆菌,研究发现单增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3种类型.单增李斯特菌能使人畜致病,造成猪、鸡等多种畜禽死亡。人感染后则主要表现为脑膜炎、败血症和单核细胞增多。婴幼儿、怀孕妇女和免疫耐受病人的感染死亡率可高达20%-30%。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,人们食用的肉、奶、蛋、水产品、蔬菜以及冷冻食品等均有不同程度的污染,在美国李斯特菌被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病菌之一。因此快速,准确检测出单增李斯特菌对临床诊断和治疗有重要意义。目前有以下几种检测方法。

1 传统的细菌培养法

食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌,以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAM P)等免疫学检测,被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型[1]。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括:冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30 d,有时甚至长达一年。常温增菌需培养24 h至7 d。故传统检测方法需要7-11 d才能分离鉴定出李斯特氏菌,故传统方法检测周期较长。

2 免疫学方法

2.1 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是20世纪90年代发展起来的将层析法与免疫胶体金相结合的诊断技术,具有快速、操作简便、与酶联免疫法相似的特异性及灵敏度的优点,广泛用于样品的检测[2]。采用免疫胶体金层析技术,对LM进行检验分析,可取得良好的效果。免疫胶体金技术与酶免(EIA)相比有着许多优越性。首先,它不需要酶联免疫法中所要求的底物(显色剂),因而可省去一些操作步骤,如洗涤、终止等,使操作简单化。因此胶体金检测只需10-20 min,而酶免(EIA)需要60 min以上;其次,胶体金法无污染,不会危害操作者以及污染环境,而这些问题在酶免法中常遇到;此外胶体金技术还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产品永不褪色等优点[3]。胶体金免疫层析法可在食物、农产品测定中作为一个粗筛的快速检测方法。

2.2 聚合酶免疫检测方法(assurance poly clonal enzyme immunoassay,EIA)

这一方法是将样品增菌液和阳性对照加到酶标板的微孔内,微孔的内壁上固定有对李斯特氏菌抗原有高度特异性的抗体。李斯特氏菌抗原在微孔内形成抗体-抗原复合物。一般操作方法是在样品板内加入抗李斯特氏菌特异抗体,进孵育、冲洗程序,然后加入碱性磷酸酶结合剂,使酶与抗原结合,冲洗后加入底物显色,用405-410 nm的光度计读数,计算临界值。当样品测量值大于临界值时为阳性结果,可疑阳性结果还需经传统方法检测。EIA方法需要进行两次前增菌程序,每次增菌培养时间为24 h,后续的检测过程大约需要2-4 h,因此比传统检测方法节省了很多时间。Feldsine等[4-5]运用EIA方法检测食品样品和环境中物体表面李斯特氏菌和李斯特氏菌属。并和USDA/F SIS(U.S.Department of Ag riculture/Food Safety and Inspection Service)传统培养检测方法进行比较。结果表明,EIA方法与USDA/F SIS传统培养检测方法的检测结果在统计学上是一致的。

2.3 自动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)分析方法

此分析系统是依据免疫学酶联免疫反应(ELISA)原理对李斯特氏菌等致病菌进行快速检测的方法,作为夹心反应,固相容器(SPR)用抗李斯特氏菌抗体包被,捕获细菌抗原,抗原-抗体复合物可被标记有碱性磷酸酶的抗细菌第二抗体检测,形成酶复合物,酶复合物在酶催化下将底物(4-甲基伞形磷酸酮)分解成具有荧光的产物(4-甲基伞形酮),该产物由仪器中的光扫描器检测荧光强度(荧光强度与李斯特氏菌的含量成正比),并由计算机自动分析结果。由于该仪器检测的假阴性率为零,假阳性率＜5%,因此该方法适合大批量样品的筛选和快速检测,阴性结果可直接报告;阳性结果可经过纯培养后,进一步用国标法或全自动生化分析仪进一步确认,12-24h即可报告结果[6]。有资料显示VIDAS检测系统的特异性可达 96%,灵敏度为73%[7]。此方法采用计算机自动分析系统,不但简便而且减少了人为误差,可在3d内报告结果。

2.4 SPA-ELISA

姜迪来等[8]利用HRP-SPA(辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白)代替酶标二抗,采用一步法ELISA检测肉品中的单增李斯特氏菌,并建立了SPA-ELISA检测肉制品中李斯特氏菌的检测方法。研究发现,HRP-SPA可完全代替酶标二抗用于对李斯特氏菌的检测。结果还显示,SPA不能单独与抗原或抗体良好地结合,而只与抗原抗体免疫复合物结合良好,对兔血清中的IgG具有较好的结合能力。故使得酶标SPA有代替酶标二抗而进行相关研究的优势。这样省去了制作抗体的麻烦。

2.5 免疫磁性分析(IMS)

IMS的基本原理是抗原抗体反应。寇运同等[9]指出用免疫磁珠捕集法快速检测食品中单增李斯特氏菌的方法,可以将检验周期缩短至1d以内。此方法并被AOAC(证书号930701)和AF NOR(法国标准协会)批准采用。IMS-ELISA法是将IMS应用于免疫分析法。这一方法的优点在于在较低的菌液浓度时也可通过免疫磁珠的富集作用进行检测,缩短前增菌时间,并进一步降低了单增李斯特氏菌的检测限。该方法也存在缺点,当磁珠用单抗包被时无法识别所有的李斯特氏菌菌株,而用多抗包被时又不能区分致病性和非致病性李斯特氏菌,因此,免疫磁性分析缺乏种间的特异性,不能消除交叉反应,与其他杂菌可能发生非特异性结合,仍需用溶血实验等生化实验进行进一步的验证[10]。

3 分子生物学检测方法

随着核酸探针杂交技术的应用,使对单核细胞增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平。

3.1 探针检测技术

这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子生物学技术。早在1988年,Atin等[11]就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一个500 bp DNA片断并测序,以此序列合成4种寡核苷酸探针,以32P标记该探针,经斑点杂交实验证实,该探针只与李斯特氏菌反应,与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴性,表现出很好的特异性。但探针杂交无法分辨死菌和活菌,尽管通过增菌可使死菌比例减少,相对地减少假阳性,但并不能完全杜绝假阳性结果。随着探针技术的逐渐成熟,人们开始关注将多个DNA特异性探针固定到芯片上,制成基因芯片。基因芯片的特点是可同时检测多种菌,可以减少实验次数,并且检测所需的引物较少[12]。

3.2 聚合酶链式反应(poly merase chain reaction,PCR)检测技术

PCR的发展已经相当成熟,广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计,一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hly A、iap、inl、Dth-18等毒力基因。利用PCR方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好,不足之处是灵敏度较低;将样品培养物经化学抽提后再进行扩增,提高了样品的检出率[13];并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。例如Nogva等[14]运用 5′-核酸酶PCR对单增李斯特氏菌定量;Choia等[15]运用cPCR对李斯特氏菌进行定量;Long等[16]以hly为靶基因,采用PCRELISA联合检测技术。

4 PCR-ELISA联合检测技术

1999年SCHEU等以单增李斯特菌mpl基因为基础,建立了PCR-ELISA快速检测方法,需时5-6 h,特异性较高,但未将该方法应用于食品样品的检测[17]METZGER-BODDIEN等应用沙门菌特异的PCR-ELISA试剂盒对沙门菌人工污染的食物样品进行检测,结果与标准的分离培养方法符合率高达98%[18]。PCR-ELISA技术并非PCR与ELISA的简单结合,有其自身的技术要点[19]。首先捕获探针必须和PCR扩增产物内部序列互补,捕获探针序列的长度最好在17-40 nt之间。PCR-ELISA检测优于PCR检测的特点:(1)快速:获得PCR产物后,ELISA检测约需6 h,而琼脂糖凝胶电泳检测约需2 h。由于PCR-ELISA在增菌12 h与PCR在增菌20 h的检测敏感性相当,检测时间仍然缩短了4 h。(2)安全:ELISA检测所用试剂对人体较安全,避免了琼脂糖凝胶电泳的EB污染。(3)可大量应用:每块微孔板有96个检测孔,而PCR检测受电泳槽、加样槽的大小等限制,检样量相对较小目前,对LM快速检测方法的研究,绝大部分尚停留在实验室阶段,很大程度局限于ELISA法和PCR法,而免疫胶体金层析法检测LM具有快速、便捷的优点。(4)可广泛应用于质检、卫生、边检、医院,也可用于家庭进行简易检测。其良好的特异性,较高的灵敏度,可靠的重现性和稳定性,为今后的食品中LM检测提供了一个更为理想的快速检测方法。

[1]余淑冰,梁景涛,周强忠,等.单核细胞增生李斯特菌污染调查及快速检验方法的比较[J].中华预防医学杂志,1998,32(4):240.

[2]宋 农,李君文,王新为,等.胶体金探针制备及滴金免疫法检测产肠毒素金葡菌[J].中国公共卫生,2002,18(9):1143.

[3]许文炯,王秀华,贾力敏,等.胶体金法快速检测乙肝表面抗原[J].中国卫生检验杂志,2002,12(1):73.

[4]Feldsine PT,Lienau AH,Forcey RL,et al.Assurance poly clonal enzyme immunoassay for detection of Listeria monocytogenes and related Listeria species in selected foods:collaborative study[J].Journal of AOAC International,1997,80(4):775.

[5]Feldsine PT,Lienau AH,Leung SC,et al.Method extension study to validate applicability of AOAC Official Method 996.14Assurance poly clonal enzy me immunoassay for detection of Listeria monocytogenes and related Listeria spp.from environmental surfaces:collaborative study[J].Journal of AOAC International,2002,85(2):460.

[6]林 涛,刘真真,杨雪娇,等.全自动荧光酶免疫分析仪-国标法检测水产品中单核细胞增生李斯特氏菌的研究[J].中国卫生检验杂志,2008,18(4):655.

[7]Vaz-Vel HO M,Duarte G,Gibbs P.E valuation of mini-VIDAS rapid test fordetection of Listeria monocytogenes from production lines of fresh to cold-smoked fish[J].Journal of Microbiolog ical Methods,2000,40(2):147.

[8]姜迪来,凌宗帅,王克刚,等.SPA-E L ISA用于单核细胞增生性李斯特菌检验的应用研究[J].肉类研究,2006(6):47.

[9]寇运同,雷质文,林修光,等.用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌[J].检验检疫学,2001,11(6):12.

[10]李晓红,蒋琴娣,吴仲梁,等.利用IMS/PCR方法快速检测食品中单增李斯特菌[J].检验检疫科学,2003,13(6):20.

[11]Atin RD,Barry AW,Darlene S,et al.Synthetic oligodeoxy ribonucleotide probes for detection of Listeria monocytogenes[J].Applied and E nvironmental Microbiology,1988,54(12):2933.

[12]顾 鸣,韩 伟,关 嵘,等.常见食源性致病菌基因芯片鉴定技术[J].中国卫生检验杂志,2005,15(11):1309.

[13]姜永强,雷祚荣,李 瑾,等.应用PCR方法快速单核细胞增生李斯特菌[J].中华预防医学杂志,1998,32(1):19.

[14]Nog VK,Rudik,NATE R,et al.Application of 5’-Nuclease PCR for quantitative detection of L isteria monocy tog enes in purecultures,water,skim milk,and unpasteurized milk[J].Applied and Environment Microbiology,2000,66(10):4266.

[15]Choia SW,Hong BHC.Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in milk using competitive PCR[J].International Journal of FoodMicrobiology,2003,84(1):79.

[16]Long F,Zhu XN,Zhang ZM,et al.Development of a quantitative poly merase chain reaction method using a live bacterium as internal control for the detection of Listeria monocytogenes[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2008,62(4):374.

[17]Scheu P,Gasch A,Berghof K.Rapid detection of Listeria monocytogenes by PCR-ELISA[J].Lett Appl Microbiol,1999,29(6):416.

[18]Metzger-boddien C,Bostel A,Kehle J.PCR-ELISA for analysis of food samples[J].J Food Prot,2004,67(8):1585.

[19]黄留玉,王 恒,史兆兴,等.PCR最新技术原理、方法及应用[M].北京:化学工业出版社,2005.