与HLGR肠球菌相关的氨基糖苷修饰酶的研究进展

刘 晶

(首都医科大学附属北京妇产医院检验科,北京 100026）

肠球菌是条件致病菌,广泛存在于自然界,常栖居在人、动物的肠道和女性生殖道,很少引起严重的感染。近年来,随着广谱抗生素的大量使用,肠球菌成为医院感染的三大病原菌之一,能够引起心内膜炎、菌血症和尿路感染等[1]。对于严重的肠球菌感染临床上常采用细菌细胞壁活性抗菌药物,如青霉素或糖肽类药物,与氨基糖苷类抗生素联合治疗[2]。但当肠球菌获得氨基糖苷类耐药基因介导产生氨基糖苷类修饰酶,会对高浓度氨基糖苷类产生耐药性,从而失去与细菌细胞壁活性抗菌药物的协同作用[2],加大了治疗的难度。在耐药菌中以庆大霉素高水平耐药肠球菌(HLGR）为主,故全面了解肠球菌的耐药机制及耐药性的传递特性,对于指导临床合理使用抗生素,新抗生素的研发起着重要作用。

1 庆大霉素修饰酶及其基因特点

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS）建议,肠球菌对庆大霉素高耐药的标准是MIC〉500 μ g/ml。氨基糖苷类修饰酶(AME）是造成高耐药产生的主要原因。目前报道的高耐庆大霉素的氨基糖苷修饰酶主要有以下几种:

1.1 双功能酶 AAC(6′）-APH(2″）双功能酶 AAC(6′）-APH(2″）是目前为止发现的最重要的AME,肠球菌对庆大霉素高水平耐药几乎都由此酶介导,由耐药基因aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia 编码[3],普 遍认 为 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因存在肠球菌、金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌中,基因序列号M13771,开放阅读框(ORF）1 437 bp。Joseph等证实aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia是2个基因的融合体,只含有一个起始密码子和一个终止密码子。这两种基因在结构上是完整统一的,但各自发挥作用而不增强对方的耐药活性。AAC(6′）-APH(2″）可以介导对庆大霉素、妥布霉素、地贝卡星、奈替米星、阿米卡星、异帕米星及福提米星的耐药,但链霉素不受影响[4]。由于AAC(6′）-APH(2″）双功能酶使肠球菌对除链霉素以外的几乎所有氨基糖苷药物高度耐药(MIC〉500 μ g/ml）,因此对高耐氨基糖苷类肠球菌的筛选,一般仅用庆大霉素和链霉素即可,如肠球菌产AAC(6′）-APH(2″）双功能酶则消除了这些抗生素与作用于细胞壁药物的协同杀菌作用。

1.2 氨基糖苷磷酸转移酶APH(2″）-Ic:aph(2″）-Ic基因最初发现于鸡肠球菌中,随后在屎肠球菌和粪肠球菌中也被发现[2]。携带aph(2″）-Ic基因的肠球菌对庆大霉素呈中等水平耐药,但是能够破坏氨苄西林与庆大霉素的协同作用[5]。因此,应用浓度为500 μ g/ml庆大霉素检测其耐药基因(破坏与作用于细胞壁药物的协同作用）,携带aph(2″）-Ic基因的肠球菌就被漏检,可能错误地认为氨基糖苷与作用于细胞壁药物有协同作用。另一方面,因为256μ g/ml和 500 μ g/ml之间呈2倍的稀释浓度关系,携带aph(2″）-Ic基因的菌株在使用500μ g/ml庆大霉素筛查试验随时可以轻微的生长。这些菌株可能被错误地认为携带aac(6＇）-Ie-aph(2″）-Ia基因,这样,错误地认为对多种氨基糖苷耐药,其实他们对于氨苄西林与阿米卡星、奈替米星或者地贝卡星的协同效应是敏感的。

1.3 氨基糖苷磷酸转移酶APH(2″）-Id APH(2″）-Id由Susan F.Tsai等[6]于1998年首次报道,是一个新发现的氨基糖苷修饰酶,由 aph(2″）-Id编码,基因序列号:AF016483,ORF是906 bp。APH(2″）-Id可以修饰庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、耐替米星和地贝卡星,而且MIC均大于2 000 mg/L。在协同杀菌试验中,对仅含有APH(2″）-Id的肠球菌,未检测到氨苄西林加庆大霉素或耐替米星的协同作用,但同样剂量的氨苄西林加阿米卡星或新霉素却显示了协同杀菌作用。

1.4 氨基糖苷磷酸转移酶APH(2″）-Ib APH(2″）-Ib由Susan J.Kao等[7]于2000年首次报道,APH(2″）-Ib是在屎肠球菌SF11770中发现的一个高耐庆大霉素的基因,基因序列号是:AF207840,ORF是897 bp。APH(2″）-Ib介导了肠球菌对庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星和地贝卡星高水平耐药,消除了氨苄西林与庆大霉素的协同杀菌作用。携带APH(2″）-Ib的菌株在理论上应对氨苄西林与阿米卡星的联合用药敏感,在对屎肠球菌SF11770的协同杀菌试验中,氨苄西林与庆大霉素无协同作用,但氨苄西林与阿贝卡星显示了一定的协同作用,其在体内的有效性需进一步证实。

1.5 氨基糖苷乙酰转移酶AAC(6′）-Im 在屎肠球菌SF11770种发现的一种新的耐药基因[8],其位于aph(2″）-Ib下游44bp处,而且aph(2″）-Ib和aac(6′）-Im 是各自独立的2个开放阅读框(ORF）,拥有各自的核糖体结合位点。aac(6′）-Im 编码产生 AAC(6′）-Im,与双功能酶中的 AAC(6′）-Ie的结构域 80%相似,56%相同。当 aph(2″）-Ib和 aac(6′）-Im同时存在时,对某些氨基糖苷类耐药性明显比各自单独存在时要高。

1.6 氨基糖苷磷酸转移酶APH(2″）-Ie APH(2″）-Ie是由瞿婷婷等[9]于2006年发现并报道,APH(2″）-Ie是在铅黄肠球菌HZ95中发现的最新的高耐庆大霉素的基因,基因序列号:AY677166,ORF是905 bp。研究发现,在屎肠球菌和鹑鸡肠球菌中也检测到这个基因。APH(2″）-Ie可导致对庆大霉素及奈替米星的高水平耐药,但并不介导链霉素、阿米卡星的耐药性。

2 耐药基因的转移

氨基糖苷类基因借助于转座子、质粒等可移动元件在同种或不同种细菌间传播,抗菌药物不合理应用是导致耐药相关基因传播的重要原因。

2.1 质粒介导的耐药性转移

目前,研究较多的是性信息素应答性质粒,主要存在于粪肠球菌中,并在粪肠球菌间传递,菌体间的转移频率可高达100-10-2(每个供体菌所对应的转化结合子的数目）。另一种与耐药质粒相关的质粒是多宿主质粒,它可以跨种属进行质粒的转移,但转移频率较低。最近,在屎肠球菌中还发现了一种质粒pMG1(65.1 kb）,它既有别于信息素应答性质粒,不被信息素诱导;也有别于多宿着质粒,转移频率达到10-4。pMG1可在粪肠球菌间、屎肠球菌间、粪肠球菌与屎肠球菌间、屎肠球菌与海瑞肠球菌间转移,显示其在肠球菌间有很强的转移能力。

2.2 转座子介导的耐药性转移

转座子是位于染色体或质粒上的一种可以独立于质粒存在的可转移性基因序列。最简单的转座子是一个插入序列(IS）,它含有编码转座过程必须遗传信息的基因,如:转座酶基因。复合型转座子有两端的插入序列及中心区的获得性基因,如:耐药基因。在肠球菌中发现了多种含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia并类似于Tn4001的复合型转座子,如Tn5281及其类似结构、缺陷型Tn4001样结构、Tn5384等。

Tn5281[10]:1991年Hodel-Christian等[11]首先在粪肠球菌中发现Tn5281,之后在屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和棉子糖肠球菌等多种肠球菌中也有发现。复合型转座子Tn5281与金黄色葡萄球菌Tn4001和无乳链球菌Tn3706具有相同的结构,由两个互为反向重复序列的插入序列IS256连接在双功能的氨基糖苷修饰酶基因aac(6'）-Ie-aph(2”）-Ia两侧构成。IS256编码的转座酶能识别IS256末端的反向重复序列,催化转座子的移动。转座子Tn5281的变异型较多,主要表现为左侧或右侧的 IS256缺失型、Tn5281-IS257杂交型和缺陷型Tn4001。肠球菌中HL GR基因主要位于Tn5281上[20],转座子可整合于接合质粒上,从而促进了HLGR基因在菌株间的散播。

Tn5384[12]:是粪肠球菌CH116中发现的长26 kb的转移元件,是第1个报道的双功能修饰酶基因与其他耐药基因共转移的例子。此转座子结构中共有3个IS256,其中2个位于双功能修饰酶基因两侧,形成类似Tn4001的结构,第3个IS256位于最左端插入位点下游23 kb处,它与第2个IS256中间可能有耐红霉素基因定位。

Tn5385[13]:是整合入粪肠球菌CH19和CH116染色体上的1个更大的转座子,它含有多种转座子样结构(Tn5281、Tn5384、Tn4001、Tn552）及插入序列(IS256、IS257、IS1216）,整个复合结构的两端为正相重复的IS1216。含有多种耐药基因:aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia、ant(6′）-Ia、β -内酰胺酶 基因,以及对红霉素、升汞、四环素、米诺环素的耐药基因。Tn5385转移到粪肠球菌受体菌中的频率低,且通过染色体重组出现两种转移菌类型。

Tn924[14]:是位于粪肠球菌SF350染色体上的一个高水平庆大霉素耐药转座子,可通过共存的接合质粒转移,不含质粒的只在染色体上有Tn924的菌株不能转移其耐药性。基因全长27 kb,可能含有类似截断的Tn4001-IS257杂交结构。

3 耐药机理研究的实验室方法

根据NCCLS的标准,肠球菌在含庆大霉素 500 μ g/ml的BHI肉汤中,经24小时培养,有细菌生长或琼脂培养基中有超过1个菌落生长,即为高水平耐药。

3.1 修饰酶活性检测氨基糖苷修饰酶的酶活性检测一般采用磷酸纤维素膜结合测定法(phosphocellulose paperbinding assay）,不同放射性元素标记的乙酰辅酶A、ATP在修饰酶的作用下,将放射性元素转移到吸附于磷酸纤维素膜的庆大霉素上,通过放射性计数检测酶的活性。

3.2 耐药基因的检测通过 PCR[15,21]、探针杂交[16,20]等方法进行。

3.3 接合转移试验性信息素介导的高频质粒转移试验可在BHI肉汤中进(broth mating法）,对于非信息素介导的质粒或转座子转移试验可借助固体表面进行。

3.4 转座子的检测采用两种方法:①Long-PCR[17,20]:是通过长距离PCR限制性片段长度多态性(L-PCR-RFLP）,分析转座子结构变异。②巢氏PCR(Nested-PCR）技术[18]。

4 结束语

随着氨基糖苷类耐药基因的广泛流行,特别是肠球菌中的aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因,使得氨基糖苷类药物联合应用治疗受到限制。目前,大部分肠球菌对庆大霉素高水平耐药,绝大多数对链霉素也高水平耐药,这就导致肠球菌实际上对临床上所有常用的氨基糖苷类药物都产生耐药。因此,要求加强新药的研究、开发。阿比卡星是一种新的氨基糖苷类药物,是迪比卡星的衍生物,目前只在日本用来治疗对庆大霉素和新青霉素耐药的金黄色葡萄球菌感染,阿比卡星受双工能酶AAC(6′）-APH(2″）介导影响的几率要比庆大霉素小的多,因此在治疗一些含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因的肠球菌感染中可能有用[2]。利奈唑胺是一种新的化学结构恶唑烷酮类药物,有望用来治疗严重的肠球菌感染[19]。

[1]Treitman AN,Yarnold PR,Warren J,et al.Emerging incidence of Enterococcus faecium among hospital isolates[J].J ClinMicrobiol,2005,43(1）:462.

[2]Chow JW.Aminoglycoside resistance in enterococci[J].Clin Infect Dis,2000,31(2）:586.

[3]Ferretti JJ,Gilmore KS,Courvalin P.Nucleotide sequence analysis of the genespecifying the bifunctional 6＇-aminoglycoside acetyltransferase 2”-aminoglycosidephosphotransferase enzyme in Streptococcus faecalis and identification and cloning of gene regions specifying the two activities[J].J Bacteriol,1986,167(2）:631.

[4]Leclercq R,Dutka-Malen S,Brisson-Noël A,et al.Resistance of enterococci to aminoglycosides and glycopeptides[J].Clin Infect Dis,1992,15(3）:495.

[5]Chow JW,ZervosMJ,Lerner SA,et al.A novel gentamicin resistance gene in Enterococcus[J].Antimicrob Agents Chemother,1997,41(3）:511.

[6]Tsai SF,Zervos MJ,Clewell DB,et al.A new high-level gentamicin resistance gene,aph(2”）-Id,in Enterococcus spp J.Antimicrob Agents Chemother,1998,42(5）:1229.

[7]Kao SJ,You I,Clewell DB,et al.Detection of the high-level aminoglycoside resistance gene aph(2”）-Ib in Enterococcus faecium[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(10）:2876.

[8]Chow JW,Kak V,You I,et al.Aminoglycoside Resistance Genes aph(2”）-Ib and aac(6'）-Im detected together in strains of both Escherichia coli and Enterococcus faecium[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(10）:2691.

[9]瞿婷婷,张 樱,俞云松,等.一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph(2”）-Ie[J].中华医学杂志,2006,86(9）:596.

[10]Byrne ME,Gillespie MT,Skurray RA.Molecular analysis of a gentamicin resistance transposonlike element on plasmids isolated from North American Staphylococcus aureus strains[J].Antimicrob Agents Chemother,1990,34(11）:2106.

[11]Hodel-Christian SL,Murray BE.Characterization of the gentamicin resistance transposon Tn5281 from Enterococcus faecalis and comparison to staphylococcal transposons Tn4001 and Tn4031[J].Antimicrob Agents Chemother,1991,35(6）:1147.

[12]Rice LB,Carias LL,Marshall SH.Tn5384,a composite enterococcal mobile element conferring resistance to erythromycin and gentamicin whose ends are directly repeated copies of IS256[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(5）:1147.

[13]Rice LB,Carias LL.Transfer of Tn5385,a composite,multiresistance chromosomal element from Enterococcus faecalis[J].J Bacteriol,1998,180(3）:714.

[14]Thal LA,Chow JW,Clewell DB,et al.Tn924,a chromosome-borne transposon encoding high-level gentamicin resistance in enterococcus faecalis[J].Antimicrob Agents Chemother,1994,38(5）:1152.

[15]Vakulenko SB,Donabedian SM,Voskresenskiy AM,et al.Multiplex PCR for detection of aminoglycoside resistance genes in enterococci[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(4）:1423.

[16]Huycke MM,Spiegel CA,Gilmore MS.Bacteremia caused by hemolytic,high-level gentamicin-resistant Enterococcus faecalis[J].Antimicrob A-gents Chemother,1991,35(8）:1626.

[17]Simjee S,Manzoor SE,Fraise AP,et al.Nature of transposon-mediated high-level gentamicin resistance in Enterococcus faecalis isolated in the United Kingdom[J].J Antimicrob Chemother,2000,45(5）:565.

[18]Saeedi B,Nilsson M,et al.Genetic relatedness among Enterococcus faecalis with transposon-mediated high-level gentamicin resistance in Swedish intensive care unit[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(2）:162.

[19]Metallidis S,Chatzidimitriou M,Nikolaidis P,et al.Compartitive in vitro activity of linezolid and five other antimicrobials against nosocomial isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus,methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and vancomycin-resistant Enterococcus faecium[J].J Chemother,2003,15(5）:442.

[20]Feizabadi MM,Shokrzadeh L,Sayady S,et al.Transposon Tn5281 is the main distributor of the aminoglycoside modifying enzyme gene among isolates of Enterococcus faecalis in Tehran hospital[J].Can J Microbiol,2008,54(10）:887.

[21]Leelaporn A,Yodkamol K,Waywa D,et al.A novel structure of Tn4001-truncated element,type V,in clinical enterococcal isolates and multiplex PCR for detectingaminoglycoside resistance genes[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2008,31(3）:250.

[22]Arias CA,Murray BE.Emergence and managemeng of drug-resistant enterococcal infections[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2008,6(5）:637.