人脐带间充质干细胞的研究进展

杨文成 董有海

·综述·

人脐带间充质干细胞的研究进展

杨文成 董有海

2 hUCMSC的分离和培养

胞外基质中某些生长因子的释放和细胞对胞外基质中生长因子的敏感性；但持续的低强度超声波却会降低细胞的增殖能力[9]。

3 hUCMSC的一般生物学特性

3.1 hUCMSC的细胞形态

培养的24 h内即可观察到贴壁的成纤维样细胞，多呈梭形，也可见到多角形细胞[10]；传代后的细胞为形态相对均一的梭形，呈平行排列或旋涡状排列生长。透镜电镜观察显示，hUCMSC核大，呈圆形或椭圆形，位于胞浆的中央，核仁明显，常染色质多，异染色质少，胞浆少，细胞器以粗面内质网和线粒体为主，胞浆内有较多游离核糖体。多次传代后，细胞的核型保持稳定。

3.2 hUCMSC表面抗原标记

研究发现，hUCMSC高表达MSC标记（CD73、CD90、CD105）和黏附分子标记（CD54、CD13、CD29、CD44），低表达MHC-Ⅰ分子标记（HLA－ABC）等，不表达造血干细胞标记（CD34、CD45、CD14）、内皮细胞标记（CD33、CD133）及MHC-Ⅱ分子标记（HLA-DR、-DA、-DP、-DQ）等；hUCMSC还表达部分hESC标记，同时也表达一些转录因子，这些转录因子多为hESC所表达，如Oct-4、Sox-2、Nanog等[9-11]。在hESC中，上述分子是细胞自我更新和多向分化的主要调控分子[12]，如Oct-4是hESCs特异性基因，对维持干细胞未分化状态及细胞的多分化潜能具有重要作用[13]；Nanog分子对保持细胞自我更新和增殖能力起重要作用；这些分子在细胞传代到第9代及冷冻复苏后仍有表达。因此，有理由相信hUCMSC具有和hESC相似的调控机制和生物学特性，说明hUCMSC是一种较为原始的干细胞，是介于hESC和成体干细胞之间的一类MSC，提示hUCMSC可能具有更强的可塑性和极低的免疫原性。

3.3 hUCMSC的免疫原性和免疫调节作用

3.3.1 hUCMSC具有极低的免疫原性

hUCMSC不表达HLA-DR、-DA、-DP、-DQ[11，13]，低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、HLA-ABC[13]。大量研究证实，hUCMSC表达CD106、HLA-ABC明显低于BMSC，因此hUCMSC具有更低的免疫原性[14]；另外，hUCMSC表达某些hESC标记，提示hUCMSC的免疫原性极低。野向阳等[15]对正常的hUCMSC及经γ-干扰素刺激48 h后的第3代hUCMSC，应用流式细胞仪检测其HLA-ABC、HLA-DR、CD80和CD86的表达情况，结果表明hUCMSCs低表达HLA-ABC，不表达HLA-DR、CD80和CD86；经γ-干扰素刺激后的hUCMSCs只增加对HLA-ABC的表达，而HLA-DR、CD80、CD86仍未表达。在脑损伤和退行性变的动物模型中进行细胞移植治疗发现，机体并未产生针对这些移植细胞的排斥反应[16]；与BMSC相比，UCMSC移植后产生免疫排斥反应的可能性较低[17]，说明hUCMSC为一类免疫缺陷细胞，hUCMSC存在同种异体移植时逃避免疫应答的可能。但在一项为期180 d的研究中发现，hUCMSC植入体内6个月后却出现了宿主抗移植物的排斥反应，这可能是由于在宿主免疫作用下，出现了干细胞免疫抑制丢失的现象[18]。宿主对移植的hUCMSC长期的排斥反应尚有待进一步研究。

3.3.2 hUCMSC的免疫调节作用

将hUCMSC和经丝裂原刺激的T细胞共培养发现，T细胞分泌INF-c和TNF-a的水平明显降低，并且T细胞的增殖能力受到明显抑制[19－20]；但是，hUCMSC分泌HGF、IL-10、TGF-b1、COX-1、COX-2的水平没有明显降低，说明在体外hUCMSC对T淋巴细胞具有负调节作用[19]；同样，在体外hUCMSC抑制再生障碍性贫血患者血液中T细胞的增殖，改变血液中倒置的CD4+/CD8+比例，抑制再生障碍性贫血患者造血负调控因子白细胞介素2、γ-干扰素分泌水平[21]；向多发性硬化患者体内输注hUCMSC，可控制病情[22]。这些研究说明，hUCMSC在体内、外对T淋巴细胞具有负调节作用。

3.4 hUCMSC的增殖特性和增殖周期

hUCMSC具有良好的增殖性能，但是不同的实验中其倍增时间存在不同[2]。在早期的传代培养中，细胞倍增时间约为20～24 h[23-24]，传代后的倍增时间会缩短[25－26]，传至20～30代其增殖活性仍未降低[14]。BMSC会随着机体的老化而导致数量减少，增殖活性和分化能力不断降低[1]，但是hUCMSC不存在这样的问题。研究表明，hUCMSC的增殖活性与分娩时母体的年龄、胎儿性别、分娩方式等无关，与是否足月产和足月产的婴儿体重有关，足月产和较重婴儿的hUCMSC的增殖活性和分化能力较高，其原因和机制尚不清楚。

hUCMSC在接种后的前3天处于潜伏期，细胞无明显增殖；从第4天开始，细胞进入对数增长期，维持至第8天；之后进入平台期。在对数生长期，第1～10代细胞的倍增时间约为20～24 h[23-24]，明显低于BMSC的倍增时间（40 h[14]）。

流式细胞技术分析细胞周期显示，第2～6代hUCMSC为正常二倍体细胞，80%以上的细胞处于G0/G1期，G2/M期细胞为6.24%（4.86%～10.21%），S期细胞为3.73%（1.45%～7.57%）。

3.5 hUCMSC的多向分化潜能

hUCMSC在体外被证实可向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、神经胶质细胞、多巴胺能神经细胞、内皮细胞、肝细胞、胰岛样细胞、平滑肌细胞、生殖细胞等方向分化[9－10，28-31]；在体内，可分化为神经细胞、多巴胺能神经元细胞、光敏感感受器神经细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等[31－32]。与BMSC相比，多数报道证实hUCMSC具有更强的向各表型细胞分化的能力，但也有不同的报道出现。以向脂肪细胞分化为例，Karahuseyinoglu等[26]报道，hUCMSC分化的脂肪前体细胞含有的脂肪小滴明显较小，且为多室性；Baksh等[33]的研究发现，在向脂肪细胞诱导至21 d时，hUCMSC来源的细胞产生了更丰富的脂肪小滴；Lu等[34]在这两种不同来源的干细胞向脂肪细胞分化的对比研究中并没有发现任何有意义的差异。

3.6 hUCMSC的成骨分化潜能

Jo等[10]的研究发现，hUCMSCs经成骨诱导后，ALP组织化学染色显示ALP活性增高，并表达骨涎蛋白（Osteonectin，ON）；Cremonesi等[35]应用Von kossa染色显示，hUCMSCs经成骨诱导后有明显的钙沉积并形成钙结节，证明hUCMSCs具有成骨潜能。研究表明，未诱导的脐带贴壁细胞中无ALP、ColⅠmRNA表达，诱导后表达ALP、ColⅠmRNA，但诱导前和诱导后成骨细胞中均有ON表达，且诱导后ON表达明显增强；hUCMSCs经诱导后形成钙化结晶，茜素红染色阳性[36]。

4 展望

与BMSC、ADMSC相比，hUCMSC具有明显的优势，但仍有一些问题亟待解决，如定向分化的方法、移植后的免疫学特性以及是否具有远期的致瘤性等。我们相信，随着研究的不断深入，hUCMSC有望成为组织工程研究中极具潜力的种子细胞。

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Q813

B

1673－0364（2010）05－0292－03

1 hUCMSCs来源

200040上海市复旦大学附属上海市第五人民医院骨科。质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）[3-5]。

2.1 hUCMSC的分离

2.1.1 酶消化法

脐带是富含胶原和葡萄糖胺的组织，胶原占脐带干重的50%，透明质酸占葡萄糖胺的70%，故多用含有胶原酶和透明质酸酶的酶液消化脐带组织以获取细胞[6－7]。将去除了脐血管的脐带组织切割成小块，然后置入酶液中消化。多数含高活性胶原酶的消化液中同时含有酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶，Ⅰ型胶原蛋白酶被广泛用于分离间质细胞[3]。在胶原蛋白酶中加入透明质酸酶，可明显加快基质的降解和缩短间质细胞分离的时间[4]。对MSC增殖和分化而言，酶的浓度和处理的时间极为重要，尤其在胶原酶和透明质酸酶联合应用时，有可能造成细胞外膜的破坏，使分离的MSC不能贴壁。脐带组织块消化时间从30 min至16 h不等[5]，主要取决于组织块的大小和酶的成分及浓度；酶消化法获得的细胞，除MSC外还含有其他类型的细胞，荧光标记和磁珠标记技术可在较短时间获得纯化的细胞。

2.1.2 组织块贴壁法

该法操作简单，直接将切成小块的脐带组织放在MSC培养液中，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养，约5～7 d后可见贴壁生长的单个长条梭形细胞从组织中移出，10～15 d时即可获得MSC[8]。在培养早期，酶消化法获得的细胞数量明显多于组织块贴壁法；但较长培养过程中，两种培养方法所获得的细胞量及细胞表型没有明显差异；贴壁法操作简单，且传代后的细胞形态及增殖活性更为稳定。

2.2 hUCMSC的培养

常用的hUCMSC培养基为a-MEM或低糖DMEM中加入10%的胎牛血清、抗生素、生长因子和营养物质等。在5% CO2、37℃培养箱中培养；2～3 d需更换一次培养液。当贴壁细胞80%融合时，可进行传代。研究发现，以低强度脉冲式超声波处理脐带及传代细胞，相同条件下可获得对照组3倍数量的细胞，且获得的细胞扩增能力明显增强；可能是因为超声波使脐带间质变得更为松散，促进了细胞增殖，并增加了

2010年6月6日，

2010年8月14日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.016

人脐带（Human umbilical cords，hUC）连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为胎儿提供营养，由三部分构成：羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华氏胶（Wharton's Jelly）的黏液结缔组织。华氏胶对脐血管起支撑和保护作用。华氏胶中存在着一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能，被称为人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）。与人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells，hESC）、骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC）和脂肪间充质干细胞（Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSC）相比，hUCMSC具有明显的优势：①成本较低，hUCs是医学废弃物；②来源丰富，全世界每年都有数亿新生儿出生；③不会给捐献者造成新的创伤和痛苦；④不涉及伦理问题；⑤hUCMSCs是一种较为原始的干细胞，表达某些hESC的特异标志，具有极强的可塑性；⑥与BMSC和ADMSC相比具有更强的扩增能力；⑦无致瘤活性和低免疫原性；⑧与BMSC相比，不会随着传代次数增加和机体年龄增长导致增殖能力和分化能力降低[1]。这些优势使hUCMSC可能成为一种更具潜力的种子细胞。本文就hUCMSC的生物学特性及其研究进展进行综述。

hUC被覆鳞状立方上皮细胞，称为脐带上皮，通常被认为来源于羊膜上皮；脐带的两条动脉和一条静脉被粘连组织华氏胶包被，该粘连组织是由特异的成纤维样的基质细胞和胞外基质构成。这些成纤维样的基质细胞具有中等量的胞浆内糖原、脂质小滴和前胶原蛋白分泌颗粒，具有成熟的宽大的内质网、成熟的高尔基体和大量的线粒体，说明这些细胞具有活跃的蛋白质合成和分泌功能；另外，这些细胞具有脯氨酸羟化酶活性，该酶为胶原合成所必需。因此，有学者推测，该基质细胞是胶原和胞外基质合成的主要细胞。2003年，Mitchell等[2]首先证实了该类细胞具有多向分化潜能；随后有多位学者从脐带华氏胶中分离到这种成纤维样细胞，证实其具有自我更新、增殖和多向分化潜能，并命名为人脐带间充