单倍体相合造血干细胞移植联合间充质干细胞输注治疗异染性脑白质营养不良

薛梅 王志东 刘静 朱玲 丁丽 韩东梅 闫洪敏 郭子宽 王恒湘

异染性脑白质营养不良（Metachromaticleukodyst rophy，MLD）是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，与芳基硫酸酯酶A的活性缺乏有关，可引起脑硫脂沉积于体内，导致中枢神经系统广泛脱髓鞘，其中以脑白质受影响最为严重。既往缺乏有效的治疗措施，患者预后不佳。近年来，国外学者报道采用异基因造血干细胞移植可改善症状、控制疾病进展，目前国内尚无相关文献。我院采用单倍体相合造血干细胞移植治疗1例MLD患者，报告如下。

1 病例资料

患儿，女性，7岁。因“步态不稳伴记忆力渐进性下降10个月”于2010年7月13日入我院。入院前10个月，患者不明原因步态不稳，肢体活动笨拙，易摔跤，智力进行性下降，语速减慢，言语不清，记忆力减退，就诊于上海某医院，经化验检查，发现白细胞内芳基硫酸酯酶A下降（13.97 nmol/17 h·mg）。颅脑MRI检查示，双侧脑室旁白质信号T2W增高，DW1高信号，提示双侧脑白质病变。染色体检查示46，XX。最终诊断为异质性脑白质营养不良，未行特殊治疗。入我院查体：体温37℃，脉搏80次/分，呼吸18次/分，血压 100/70 mmHg，神志清，瞳孔等大等圆，双眼间距增大，眼球运动正常，心肺及腹部查体无异常。神经系统检查：患者步态蹒跚，无法独自行走及直线行走，单腿站立不稳，双手指鼻不准，轮替差，言语含糊不清,轻度构音障碍，语言速度较慢，反应迟钝，记忆力、理解力、计算力减退，无面舌瘫，脑膜刺激征阴性，霍夫曼征阴性，双侧Babinskis征阳性，肌腱反射活跃，四肢深、浅感觉正常，双下肢肌力V级，肌张力稍差。辅助检查：神经肌电图检测示周围神经传导速度、F波反射、四肢体感诱发电位、双侧脑干听觉诱发电位检测结果异常；双眼视觉诱发电位检测结果正常。诊断：异染性脑白质营养不良（少年型）。患儿无全相合供者，2010年8月2日接受单倍体相合造血干细胞移植，供者为其母亲，HLA配型4/6相合，血型相同。

2 移植方法

2.1 移植方案

预处理方案采用Flu/BU/CY+ATG方案[1]。氟达拉滨（Flu）30 mg/m2·d（-10 ～ -7 d），马利兰（Bu）4 mg/Kg·d（-8 ～ -7 d），环磷酰胺 CY50 mg/Kg·d（-6 ～ -3 d），和抗人胸腺细胞球蛋白（ATG Fresenius，Germany）5 mg/Kg·d（-4 ～ -1 d）；01及 02 d 输注骨髓及外周血干细胞。

2.2 供者

供者采用重组人粒细胞刺激因子（G-CSF）5 μg/Kg·d皮下注射，于第4天在硬膜外麻醉下采集骨髓，第5天采集外周血干细胞。采集的骨髓和外周血干细胞进行有核细胞计数、CD34＋细胞测定，受者接受未去T淋巴细胞单倍型相合的骨髓输注，采集后立即输注。

2.3 GVHD预防

联合使用多种免疫抑制剂，具体方法是在联合使用环孢菌素 A（CSA）、短程氨甲蝶呤（MTX）、霉酚酸酯（MMF）的基础上加用CD25单克隆抗体（舒莱，Novartis Pharma Switzerland）预防GVHD。MTX剂量是移植后第 1 天 15 mg/m2，第 3、6、11 天为 10 mg/m2，静脉给药。CSA从移植前7天开始1.5 mg/Kg·d，至移植前1天后改为2.5 mg/Kg·d，持续18 h点滴，直到肠道功能正常时改为口服，剂量5 mg/Kg·d，分2次给药；MMF在移植后第7天给药，0.5 g/d，连用100 d。CD25单抗在移植前的2 h和移植后第4天应用，每次20 mg，持续40min静脉点滴。

2.4 间充质干细胞制备

按文献[2]方法，稍加改良后进行脐带间充质干细胞制备。经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0.5 cm3大小的组织块，加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h后，2000 r/min离心10min后收集细胞，活细胞计数。将细胞悬浮于人MSC无血清培养基中，按1×106cells/cm2接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6000 cells/cm2的密度进行传代培养。利用流式细胞技术测定细胞表型，常规感染源检定后，收集细胞用于治疗。

2.5 感染的防治与支持治疗

患者住百级层流病房，双蒸饮食，口服肠道消毒药（复方新诺明、氟康唑）。移植后7 d起应用GCSF，直到中性粒细胞达0.5×109/L，连续3次后停用。移植后Hb<80 g/L，PLT<20×109/L或有出血倾向时输注照射后红细胞和血小板。

3 结果

患儿体重20 Kg，01 d输注骨髓有核细胞数6.7×108/Kg，CD34+细胞占有核细胞的 0.22%；02 d输注外周血干细胞数为7.07×108/Kg，CD34+细胞占有核细胞的0.38%。移植后+11 d，中性粒细胞 >0.5×109/L，PLT>20×109/L;移植后+14 d，患者外周血检测白细胞芳基硫酸酯酶A为79 nmol/17 h·mg（移植前为 13.97 nmol/17h·mg）。 同时，分别于+14 d、+21 d、+28 d、+35 d患者输注脐带来源的间充质干细胞，每次细胞数量均为4.2×107。移植后+30 d植入鉴定为供者型。

并发症：预处理期间患儿不思饮食，-6 d出现癫痫大发作1次，对症处理后未再发作。+3 d口腔Ⅰ度黏膜炎，+9 d体温最高为38℃，给予抗生素治疗后控制。未出现急性GVHD和其他移植相关并发症。

4 讨论

异染性脑白质营养不良是一种常染色体隐性遗传性疾病, 发病率为1∶4万～1∶17万。本病是由于ARSA或神经鞘酯激活蛋白B的缺陷，使溶酶体内脑硫酯水解受阻，沉积于中枢神经系统的白质、周围神经系统及其他内脏组织引起，从而产生严重代谢异常的脱髓鞘病，其中第22对染色体的ARSA突变是主要致病原因。本病主要表现为共济失调、智力下降、四肢瘫痪、癫痫及精神症状等。按发病年龄和病情严重程度分为3型：①晚期婴儿型，一般于2岁前发病，早期症状为进行性肌无力，行走困难，可表现中枢性瘫痪或周围神经性瘫痪，智力下降，癫痫，视神经萎缩，延髓麻痹，一般于5岁前死亡，此型最多见；②少年型，4～14岁发病，进展缓慢，可出现智能逐渐减退，中枢性或周围性瘫痪，共济失调；③成人型，多于18岁后发病，症状与青少年晚期型相似，病情较轻，进展缓慢，以精神症状首发。本病确诊主要依赖于实验室检测血白细胞中ARSA的活性，目前尚无特效治疗方法。

异基因造血干细胞移植是治疗血液系统疾病的主要措施之一，已获得良好疗效。随着应用范围不断拓展，治疗免疫性疾病、神经系统疾病及遗传性代谢病也获得了一些成就。在遗传性代谢病中，研究较多的是粘多糖病、脂质沉积病等，主要通过移植后供者正常细胞群来纠正酶的缺乏及促进神经发育[3]。不少学者认为，唯有异基因造血干细胞移植是治愈遗传性代谢疾病的有效手段[4]。但采用异基因造血干细胞移植治疗MLD的报道较少，且基本都是个案报道。Gorg等[5]报道1例14岁确诊为少年型MLD的患者，16岁时接受造血干细胞移植，以后13年里病情长期稳定，他们认为造血干细胞移植治疗能阻止疾病进展。Pierson等[6]报道3例患有少年型MLD的同胞兄弟，在疾病不同阶段接受脐血移植情况，并随访2年，长子病情有进展，另两位患者神经症状明显改善、病情长期稳定。但Bredius等[7]报道采用骨髓移植治疗1例晚期婴儿型MLD患者，未观察到能够阻止疾病进展的疗效。

MSC是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。研究证实，MSC能加速造血恢复、减轻GVHD[8]。侯瑞琴等[9]观察了单倍体相合造血干细胞移植联合间充质干细胞输注对患者造血微循环的影响。结果提示，联合回输供者或第三方MSC可修复骨髓基质的损伤状态，移植早期外周血细胞恢复时间提前。国外学者研究发现，MSC能高表达ARSA，因而能修复ARSA缺陷的组织[10]。另一项研究显示，异基因造血干细胞移植前输注MSC，可改善MDL患者的神经传导速度[11]。Mueleman等[12]采用减低毒性造血干细胞移植联合间充质细胞（MSC），治疗1例MDL患者，随访40个月，患者神经系统症状改善，病情长期稳定。

本例患儿诊断明确，发病时间10个月，症状进行性加重而无特效治疗。在无合适全相合供者情况下，我们选择了其母亲供髓的单倍体相合造血干细胞移植。同全相合移植比较，其主要问题是有可能产生植入失败、GVHD、免疫重建缓慢导致感染等并发症。结合我们既往治疗白血病和再生障碍性贫血以及淋巴瘤等疾病取得的临床经验[1，13-15]，我们采用单倍体相合骨髓移植，同时采用联合间充质干细胞输注的方法，以促进造血恢复和神经系统症状改善，阻止患儿病情进一步发展。由于输注细胞数量多，故患儿造血功能恢复快。患儿+11 d植入成功，移植后+14 d检测ARSA水平已经明显升高，+28 d ARSA水平达到正常范围。

本结果提示，单倍体相合造血干细胞移植联合间充质干细胞输注，可以治疗异染性脑白质营养不良，安全性好，ARSA水平较快恢复，无明显急性GVHD。我们认为，在疾病诊断早期，若无全相合供者，可选择单倍体相合造血干细胞移植，以降低原发病的并发症；同时联合间充质干细胞输注，采集足量的CD34+细胞数量，均有利于患者造血恢复、症状减轻。但本结果系个案报道，且移植后时间短，长期疗效及神经系统恢复情况，有待今后进一步随访。

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