微孔阵列技术在干细胞研究中的应用

何懿 栾杰

微孔阵列技术在干细胞研究中的应用

何懿 栾杰

1 背景

传统的细胞体外培养，是将大量的细胞集中接种于相对“较大”（毫米至厘米级别）的培养空间平面模板上，如果希望通过这种方式描述某种细胞的行为，则只能将整体细胞行为平均化来描述单个细胞行为。然而，并非所有细胞群体行为都是一致的，并且有时孤立细胞的行为对于某些研究是至关重要的。例如，在干细胞研究中，由于很难单纯依靠细胞表型将干细胞与部分分化的祖细胞分离，大多数情况下成体干细胞的生长速度显著慢于祖细胞，故将单个细胞行为作为是大量细胞行为平均化的表现就会产生很大误差。利用现有的多孔细胞培养板（如96孔板）进行单细胞研究时，不仅需要消耗大量昂贵的细胞培养液，且由于其无法约束单个细胞在培养孔内的活动，利用显微镜追踪细胞行为也十分困难，最终大多导致细胞脱离显微镜视野无法追踪。这种带有一定盲目性的试验方法，无法满足对单个细胞行为研究的需要。另一方面，众多复杂的研究系统（如微流体阀、光钳、双向电泳及声波等）虽能够对单个细胞进行捕捉、操控及研究，但却过于精巧，或者不能与现有的实验室技术设备兼容。

近年来，有学者开始尝试使用微孔阵列（Microwellarrays）作为单个细胞研究的平台，这是一种利用微尺度技术（Microscale technologies）在微米级水平进行加工、制备和分析的新技术[1]，可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面制作大量（每平方厘米内有数百至数千个）微孔，其形态、排列及密度可根据实验内容而异。微孔阵列是一种相对简单的实验技术，它能够与日常实验研究设备兼容。将微孔阵列应用于生物研究领域，在控制培养过程细胞外微环境和小型化高通量实验方面表现出前所未有的潜力，可望成为解决这一领域诸多难题的重要工具[2]。近几年来，随着无需使用昂贵的“洁净室”以制造微尺度设备的软印模技术和光刻技术的出现，微孔阵列在生物医学和生物学领域的应用已越来越多[1]。

光刻（S oft lithography）技术，是在硅板衬底上覆盖光刻胶，然后在光刻胶表面放置光遮膜，再将它们暴露于紫外光下，通过光遮膜的特定空隙透过的紫外光，可将光刻胶与硅衬底交联[3]；随后，利用有机溶剂将未交联的光刻胶溶解洗脱，生成由大量微米级光刻胶形成的薄硅片组成的“模板”，然后在“模板”表面覆盖弹性印模，经热固化和剥离后可生成微孔模板，可直接用于细胞培养[4]。利用这种方法加工所得的微孔阵列，精度高，表面质量好，制作效率高，原材料的利用率接近100%[5]。

软印模多采用聚硅氧烷（PDMS）来进行制备[6]，这是一种透明的、生物相容性良好的弹性材料，可直接应用于细胞培养支架的构建。虽然PDMS因其具有疏水性，且对培养介质内的蛋白成分（如生长因子等）有较强的吸附作用，限制了其在生物工程领域的应用，但它可以作为图形转移印模，将微孔阵列设计图形转移至生物亲和力好的材料表面（如水凝胶），这样制备的微孔阵列将具备更好的物理、化学性能[4]。

利用微孔阵列可以让大量的单个细胞在数分钟内依靠重力随机沉降至微孔底部，并允许在细胞培养的数天内对其进行分析[7]。作为单细胞研究平台，微孔阵列与传统培养方法相比，并没有明显功能上的差异，但它的结构更为精巧，如果搭配低通量平台（如96孔板），同样可以进行高通量分析[4]。

但是，对于大多数微孔阵列而言，全部固定的细胞都处于共同的培养基内，就如同在同一个培养板内一样。也就是说，单个克隆的细胞很有可能通过分泌旁分泌信号因子影响邻近的细胞。除了这一不足，微孔阵列的制备和应用都非常简便，已被广泛地应用于细胞的体外培养[4]。

目前，微孔阵列技术主要应用于以下3个方面：①模拟三维环境，形成可调控的单细胞“准三维”微环境。②进行干细胞和肿瘤细胞的生物学研究，如药物筛选等。③实时显微镜动态高通量分析。

本文拟对微孔阵列技术在干细胞、细胞分化及细胞外微环境等研究领域的应用进行综述。

2 应用微孔阵列技术建立干细胞克隆培养与诱导系统

目前，干细胞研究中的主要问题之一，是对细胞外微环境中的各种因素对干细胞生长与分化的影响还不甚了解。微孔阵列技术可以用来控制培养条件，并进行高通量实验，从而成为研究体外干细胞培养及细胞外微环境的有力工具。

诱导胚胎干细胞分化的理想的实验系统，应能保证在大批量培养时，系统微环境基本保持稳定，不应产生过大的变化。同时，应当能够进行原位分析，且仍能参与其他实验过程。总之，实验系统应当简单、经济，并能与现有实验室设备通用。现有的体外细胞培养技术，很难高效率获得形态均一度良好的干细胞群。传统干细胞培养方法，是将扩增的干细胞克隆从培养平面刮下，会导致形态特别异常的克隆，细胞间尺寸和形状差异很大[8]，这种异常也会随着增殖分化传到下一代。因此，同一克隆内部或不同克隆间的局部微环境差异很大。干细胞群具有多向分化潜能，且干细胞克隆尺寸对细胞自我更新和分化具有一定影响，利用微孔阵列培养干细胞，可以有效的提高所获得干细胞群的均一度，并能够提供一套高效提纯干细胞的工艺流程。微孔阵列允许干细胞在克隆水平以高通量方式生长，也可以用于制备干细胞克隆，可以很好地控制其形状和尺寸，这可能有助于克服目前干细胞体外培养中的一些问题。经优化后的微孔阵列系统有望成为胚胎干细胞分化研究及高通量干细胞实验的良好工具，可以生成大量形态接近并易于采集的细胞集落群[9]。

因此，微孔技术已经被用来制备小鼠和人类胚胎干细胞的可调控细胞克隆。体外培养时，首先应用明胶涂层微孔基板将人类胚胎干细胞选择性粘附于微孔底部，使干细胞克隆固定于局部增殖[10]，这些细胞克隆带有可持续一段时间的多能性标记物；随后，将滋养层细胞接种至微孔阵列中，并诱导其形成用于维持胚胎干细胞群未分化阶段的单层细胞[11]。这种共培养体系既可使胚胎干细胞从滋养层细胞获得自身增殖所必须的各种因子，同时又能够对最终获得的克隆尺寸进行调控。

此外，微孔阵列的材质对于所培养的细胞有较大影响，其中聚乙二醇（PEG）微孔阵列相对于传统的悬浮培养技术，可以更好地控制干细胞群的体积、形态和均一度[12－13]。

3 利用微孔阵列分析单个成体干细胞的生长及转归

由于成体干细胞克隆非常稀少，且其形态、大小呈高度异质性，故微孔阵列非常适合作为其生物学行为的研究平台。Bhatia等[7]在玻璃盖玻片上制备直径为20～500μm的微孔，密度为每片盖玻片上10 000个微孔，将小鼠单个成体祖细胞置于微孔内进行动态分析。在培养的数天内，应用自动动态细胞显微镜追踪数千个单个细胞的扩增与死亡情况。实验表明，相同细胞群来源的克隆与少量具备高扩增能力的克隆相比，其扩增能力存在明显差异。并且，微孔内起始细胞数量的多少（1个或数个细胞）并不会对增殖能力产生明显的影响。

Cordey等[14]在另一项类似的研究中，应用聚二乙醇（PEG）水凝胶微孔阵列，研究小鼠单个神经干/祖细胞生长成多细胞团的过程。该实验与传统的采用非粘附性塑料培养皿培养相比，所获得的神经细胞活性是传统方法的两倍。利用微孔阵列可有效地隔离单个细胞，从而使其各自增殖，并可观察在不同大小的孔径中生成的神经细胞球形态。相对于传统神经细胞球培养，细胞经微孔培养生成神经细胞球，再培养1周后，干/祖细胞表型（羟乙基淀粉+嵌套蛋白+β3微管蛋白）表达率依然很高。

微孔阵列技术同样可以应用于单个造血干细胞（HSC）的行为研究。Dykstra等[15]利用PDMS微孔阵列技术，追踪小鼠单个造血干细胞的动态行为，并通过体外培养细胞扩增行为来印证细胞在体内所发挥的功能，如模拟经致死剂量照射后的小鼠血液系统的多向重建过程等。根据已有的对单个细胞分析，发现增殖中的造血干细胞的新特征，例如特殊的形态有望成为预测细胞增殖不同阶段的标志。

Lutolf等[16]利用聚乙二醇（PEG）水凝胶材质的微孔阵列进行了进一步研究，他们根据荧光活性将不同系干/祖细胞克隆从小鼠骨髓内纯化分离。实验表明，与微孔内培养的祖细胞相比，单个干细胞细胞周期能够明显延长。应用自动延时显微镜连续观察到单个细胞，可以对其增殖活性进行量化计算，可以将每个微孔内子代造血干细胞的生成数量绘制成时间相关函数。

Kurth等[17]研究了空间局限和粘附反应对CD133阳性的人造血干细胞体外培养生长的影响。他们在微孔表面被覆纤维连接蛋白涂层，研究单个细胞在其上的生物学行为。实验表明，当单个造血干细胞处于较小的微孔中，其增殖和分化都会减低。在对贴附的细胞逐个分析后发现，在较小口径微孔中的造血干细胞，DNA合成减低且造血干细胞表面标记水平增高。实验表明，将人造血干细胞固定在纤维连接蛋白被覆的微孔空间内，可以维持细胞保持干细胞状态。

综上所述，在微孔内进行成体干细胞的动态研究，表明微孔阵列会对体外单个细胞培养造成影响。此外，微孔阵列技术可以用于多种其他干细胞克隆的研究，有助于揭示干细胞调节的机制，对于研究干细胞临床应用中的调控意义重大。

4 利用细胞微阵列分析细胞克隆和调控细胞形态

大多数的体外培养系统中的细胞外微环境，与体内环境是不同的。体内环境中，细胞处于一个受调控的微环境中，受到与临近细胞相互作用、可溶性因子和细胞外基质等各方面因素的严格调控。尤其是这些信号分子的时间、空间分布受到严格调控，且不同器官之间各不相同。另外，体内环境的细胞是处于三维立体环境中，干细胞的分化是基于一系列时间和空间调节信号，而非培养皿中的二维空间。

细胞外信号对成体干细胞和胚胎干细胞转归的判断至关重要。将成体干细胞置于能独立调控其自我更新和分化的阵列微孔中，给予适当的信号，则有可能使胚胎干细胞分化为特定的细胞类型的过程，变得更为高效且可重复[18-22]。微尺度技术既可以控制细胞-微环境的相互作用，同时可结合高通量技术以检测细胞外微环境中的多种信号分子，为寻找细胞外基质中影响细胞生发的信号因子提供了可能。

利用微孔阵列将细胞固定至特定几何形态的材料上，可以研究众多影响因素对细胞形态的作用。由于细胞粘附于微孔中后，可根据粘附区域形态调整自己的外形。这种形态上的变化引起细胞骨架特征的变化，并且已被证明与细胞凋亡和增殖有关[23]。Teixeira等[24]将人间充质干细胞放置于不同面积的纤维连接蛋白表面时，在较大表面的细胞粘附并平铺生长，而较小表面的细胞则生长为球形，其中平铺生长的细胞分化为成骨细胞，而球形细胞则分化为脂肪细胞。进一步的研究表明，细胞形态影响了RhoA通道的活性，表明分化过程中的机械应力对于干细胞的分化方向至关重要。因此，可以利用微孔阵列技术调控细胞外微环境，以调整细胞分化方向。

5 展望

随着光刻和软印模技术的广泛应用和发展，微孔阵列技术已经取得广泛应用。微孔阵列技术通过控制形状、孔径结构等特征来制备微组织成型的模板，也可成为改良的生物反应器；还可通过对细胞外环境微尺度结构的控制，研究细胞生长过程中，空间和时间的影响，包括细胞间、细胞与细胞外基质和细胞与可溶性因子的相互作用等；微孔阵列技术能够同时研究多种环境因素对细胞行为的影响，可用来优化培养条件和研究材料与细胞间的相互作用。

相对于现有的细胞培养平台，微孔阵列技术可以为体外细胞培养提供一个更为精密、可控的空间环境。通过改变这些环境或构建仿真细胞外环境，达到观察细胞行为、分化、转归、信号传导以及进行细胞组装、细胞调控等目的。这一技术使人类对细胞行为的研究以及对细胞的控制提高到一个新的水平。

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1673－0364（2010）05－0298－03

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2010年7月21日，

2010年9月15日)

100144北京市中国医学科学院整形外科医院整形八科。