间充质干细胞在糖尿病细胞疗法中的研究现状

杨亚丽 李富荣

·综述与讲座·

间充质干细胞在糖尿病细胞疗法中的研究现状

杨亚丽 李富荣

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,在细胞替代治疗中有极其重要的作用。MSCs来源广泛，几乎所有的成体和胚胎组织中都有MSCs[1]。目前研究较多的是骨髓、脂肪、滑膜、脐带血、胎肝、羊膜等来源的MSCs。MSCs最重要的特性是多能性，能分化成多种不同的细胞谱系，如骨、脂肪、软骨等间质细胞谱系，以及神经元、肝细胞和内皮细胞等内胚层和神经外胚层细胞[2-3]。MSCs同样具有分化为胰岛内分泌细胞的可塑性，已经证实来源于各组织中的MSCs可以分化为有功能的胰岛素分泌细胞。本文就MSCs分化为胰岛样细胞的方法和分化机制做一综述。

一、MSCs分化为胰岛素分泌细胞

1．体外诱导：胰岛样细胞[4](insulin-producing cells，IPCs)是指能表达胰腺发育相关基因和功能相关基因(如胰岛素Ⅰ 、胰岛素Ⅱ、葡萄糖转录因子2、葡萄糖激酶、胰岛淀粉样多肽、Nestin、PDX-1和Pax 6等)并能合成、分泌胰岛素和C-肽的细胞。多种组织来源的MSCs，如骨髓、脂肪、外周血、胰腺等，都被成功诱导分化为IPCs。

用高糖培养基或高浓度尼克酰胺培养大鼠MSCs，可使细胞分化为IPCs，表达胰岛素mRNA并分泌胰岛素[5-7]。联合使用尼克酰胺、活化素A和β细胞因子的三阶段诱导方案，用高糖培养基培养糖尿病患者MSCs，能有效促进MSCs分化为IPCs，培养最后阶段分化细胞形态和胰岛非常类似，高表达PDX-1、胰岛素和胰高血糖素基因，有葡萄糖剂量相关的胰岛素分泌[7]。

脂肪组织中有大量间充质祖细胞(adipose-derived stromal cells，ADSCs),与MSCs有类似表型和分化能力。在人体，分离ADSCs创伤小、来源丰富，因而更为实用。Timper等[8]和Eberhardt等[9]学者分离出ADSCs，加入成纤维细胞生长因子培养，发现细胞表达干细胞的标记物Scf 和Thy1,并表达胰腺内分泌细胞分化产生所必须的Isl1 mRNA；分化的IPCs中Ipf1、Isl1、ngn 3、胰岛素等基因以及胰高血糖素、胰多肽和C-肽的表达水平上调。

人脐带外周血间充质祖/干细胞，是脐带血(human umbilical cord blood，hUCB)中分离的单个核贴壁细胞，有MSCs类似的表型和分化能力。Pessina等[10]发现UCB细胞在含胎牛血清的培养基中培养，即使不添加任何细胞因子和生长因子，细胞亦可表达上皮细胞的特征标记和胰腺内分泌细胞分化的必需基因Isl1、PDX-1、Pax 4和ngn 3。Chao等[11]用四阶段培养方案，从hUCB诱导出胰岛样细胞团，表达胰岛素和胰腺β细胞相关基因PDX-1、Hlxb9、Nkx 2.2、Nkx 6.1和GLUT2，对葡萄糖刺激有胰岛素和C-肽释放反应。因此，hUCB也是IPCs很重要的来源。

人类胰岛中存在胰腺祖/干细胞，有黏附生长的特性，表达MSCs的分子标记，能向骨、脂肪和软骨分化，被认为是间充质干细胞。Davani等[12]发现这些细胞有很强增殖能力，体外扩增1000倍仍维持未分化状态，不表达胰岛素mRNA。诱导分化4 d有上皮细胞簇(epithelial cell clusters，ECCs)形成， ECCs移植到糖尿病鼠能分化为成熟的胰岛功能细胞，对葡萄糖刺激有C-肽和胰岛素分泌；胰高血糖素和胰多肽的转录随时间增加。Baertschiger等[13]将胰腺MSCs体外扩增了40倍，扩增过程中细胞表达Isl1、Nkx 2.2、Nkx6.1、nestin、ngn 3、PDX-1和NeuroD，活化素A和肝细胞生长因子可诱导其表达胰岛素、胰高血糖素和葡萄糖激酶。

2．基因修饰：MSCs易于外源基因的插入，适宜作为很多疾病基因疗法的“细胞载体”。随着干细胞检测手段和载体生物学的发展，MSCs的转基因效率明显提高。已经证实很多基因，如凝血因子Ⅷ、Ⅸ、IL-3、人生长激素、人促红细胞生成素等，转入MSCs后能在细胞内表达。

Lu等[14]用逆转录病毒将人胰岛素基因转入hMSCs，hMSCs表达胰岛素mNRA，并能稳定分泌胰岛素。Li等[15]用逆转录病毒将PDX-1转入hMSCs，诱导hMSCs分化为IPCs，表达ngn 3、insulin、GK、Glut2 和胰高血糖素，微量葡萄糖能刺激其分泌胰岛素。Li等[16]使用质粒联合转染PDX-1 和BTC两个基因， 诱导MSCs分化胰腺细胞谱系，产生胰岛样结构，对葡萄糖刺激有胰岛素分泌。

3．蛋白转导：蛋白转导是近年来新出现的技术。蛋白转导域(protein transduction domains ，PTDs)或细胞穿透肽等很多肽类，能够转移进入到活细胞，而且无论在体外或体内，细胞摄入的全长蛋白和多肽都能发挥生物活性。

胰腺内分泌分化的两个重要转录因子，PDX-1和BETA2/NeuroD都含有PTD结构。Noguchi等[17-18]用PDX-1蛋白或BETA2/NeuroD蛋白转导入胰腺导管前体细胞，成功诱导其表达胰岛素。Domínguez-Bendala等[19]用TAT介导 ngn 3蛋白转导能刺激胰腺内分泌细胞分化。Kilk等[20]报道，Isl-1转录因子的同源结构能被细胞纳入，可以推论其转导后也能诱导干细胞向胰岛细胞分化。因此，利用蛋白转导技术，将PDX-1、BETA2/NeuroD、ngn 3、Isl-1等转录因子转入MSCs，诱导MSCs分化IPCs，不需要基因转染，很方便地使干细胞分化为IPCs。

4．胰腺微环境诱导：损伤组织的特点和类型，是决定MSCs移植后是否能分化及分化方向的重要因素。近年研究证明在糖尿病疾病情况下，胰腺中存在着能诱导干/祖细胞分化为IPCs的微环境。

Choi等[21]模拟胰腺损伤的动物模型，先切除大鼠60%的胰腺，2 d后取胰腺制成匀浆，提取上清液加入到生长融合的MSCs的培养基中，1周后发现明显提高MSCs分化为IPCs的效率，细胞表达胰岛素、胰高糖素、生长抑素、胰多肽的水平明显升高，有葡萄糖刺激的胰岛素分泌。Chang等[22]取糖尿病鼠胰腺组织碎片，整合到镍包被的Cytodex3微载体中，与MSCs共同培养3～4周，观察到MSCs形成胰岛样细胞团，胰岛样细胞团在高糖刺激下有胰岛素分泌，表达C-肽、胰岛素mRNA和蛋白，双硫棕染色呈阳性。

有学者直接将MSCs移植到糖尿病鼠体内，以糖尿病动物模型自身的胰腺微环境诱导MSCs分化为IPCs。Ianus等[23]将鼠类GFP标记的骨髓细胞移植到C57BL/6鼠体内，发现该细胞在胰岛中出现，占受体胰岛细胞的1.7%～3%，并能表达胰岛素、GLUT2和典型的β细胞的转录因子。Dong等[24]用BrdU标记MSCs移植治疗大鼠糖尿病，胰腺中发现BrdU和胰岛素双染细胞，证实MSCs能在胰腺中分化为IPCs；杨亚丽等[25]移植EGFP标记的MSCs至STZ诱导的糖尿病鼠胰腺包膜下，发现EGFP标记细胞能长期存活，有EGFP和胰岛素蛋白双阳性细胞出现，双阳性细胞能在局部形成胰岛样结构，并见少量EGFP和PDX-1 mRNA双阳性细胞；Wang等[26]取雄性GFP转基因鼠的骨髓细胞移植入新生雌性NOD鼠体内，2个月后在胰腺发现有移植的骨髓细胞，通过FISH发现胰岛中有供体源性细胞表达胰岛素，表明骨髓细胞在糖尿病鼠胰腺微环境中可以形成IPCs。

二、MSCs移植分化为IPCs的机制

通常认为，MSCs有跨胚层横向分化的能力，但目前此观点面对的最大挑战是干细胞与成体细胞融合的质疑(图1)。Terada、 Ying等[27-28]于2007年发现成体干细胞与其他细胞的融合，之后有人提出所有跨系/横向分化现象都是由于供体干细胞与受体组织细胞发生融合而表现出相应的生物学特性；传统观点则认为MSCs细胞基因组内有多套程序调控细胞分化，在不同外界环境中细胞选择性开启一套特定程序，从而启动MSCs定向分化成某种终末细胞。

1．融合：在探索成体干细胞可塑性的研究中发现一种新的现象——细胞融合。Terada等[27]将携带GFP和抗生素抗性基因的骨髓细胞与胚胎干细胞共同培养，在有抗生素的培养条件下，几周后产生少量的单个GFP阳性克隆,这些克隆在相应的分化条件下有胚胎干细胞的多向潜能，并同时兼有骨髓细胞的抗生素抗性、表达GFP，这些克隆核型分析出现4倍体、6倍体和XXXY的染色体核型。Ying等[28]用神经细胞与胚胎干细胞共同培养，得到类似的结果。更多的人相信正是通过细胞融合机制使骨髓细胞/干细胞能在体内分化为肝、心肌、神经、脂肪等组织细胞，所谓横向分化的证据实际上是细胞融合引发的假象，把横向分化解释为移植的干细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合，导致遗传信息转移，因而形成的杂合细胞具有两个亲代细胞的特性，可以生成成体组织。

2．分化：Wang等[26]使用INS2-CRE雄性小鼠骨髓细胞移植至雌性ROSA-stoplox-EGFP转基因鼠体内，若移植的骨髓干细胞与受体胰岛细胞融合并分泌胰岛素，会由CRE激活EGFP表达，实际上受体鼠体内没有EGFP阳性细胞，有力地证明移植的骨髓干细胞以细胞融合以外的方式分化为IPCs。杨亚丽等[25]发现，移植至STZ诱导的糖尿病鼠胰腺的MSCs能分化为IPCs，这些EGFP标记的MSCs DNA倍性均为整2倍体和少量整4倍体，排除移植的MSCs与组织细胞融合的可能。

Moriscot等[29]发现，最初分离的MSCs表达OCT4，有很长的质粒长度，OCT4是全能胚胎干细胞和生殖细胞的首要分子标记，端粒的长度与细胞增殖能力有直接的关系，这提示MSCs具有分化的多能性。最近Colletti等[30]将hMSCs移植到胎羊体内，发现细胞植入后25 h内很快增殖和启动分化，转变成为肝细胞、神经细胞、肺组织细胞等细胞类型， FISH表明MSCs移植后没有与组织细胞融合，主要通过分化来获得新的表型。随着研究的进展，MSCs的分化潜能已经衍生到多种外胚层和内胚层的组织，MSCs的分化能力也会更深刻地被认识。

三、展望

回顾过去的研究，MSCs用于糖尿病治疗取得了令人欢欣鼓舞的成果，但是仍有许多问题需要解决：(1)需要明确MSCs治疗1型糖尿病和分化为β细胞的机制；(2)MSCs长期体外扩增以及体内移植的安全性问题；(3)如何大规模的利用MSCs产生IPCs。随着研究的进一步深入和技术的提高，相信不久的将来，这些问题都会被逐一解决，使MSCs根治糖尿病成为可能。

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2009-08-31)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.029

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