羟乙基淀粉130/0.4对急性坏死性胰腺炎大鼠肾组织水通道蛋白1表达的影响

沈锐潮 陈燕昌 黄鹤光

·短篇论著·

羟乙基淀粉130/0.4对急性坏死性胰腺炎大鼠肾组织水通道蛋白1表达的影响

沈锐潮 陈燕昌 黄鹤光

重症急性胰腺炎(SAP)常并发多器官功能不全综合征，在胰外器官损害中肾功能障碍发生率仅次于肺功能障碍[1],位列第二。SAP早期大量炎症介质和细胞因子的释放造成内皮细胞破坏引起毛细血管渗漏增加是造成胰性肾病的重要发病机制。本文应用羟乙基淀粉130/0.4(HES 130/0.4)对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠进行液体复苏，观察HES 130/0.4对ANP时肾功能障碍的影响，并探讨其作用机制。

一、材料和方法

1．动物实验分组和模型制备：雄性SD大鼠48只，体重200～250 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号：SCXK沪2007-0005)。按数字表法随机分为对照组、ANP组及HES组。参照杨波等[2]方法，胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠1.0 ml/kg体重制作ANP模型。HES组在制模后经股静脉滴注HES 130/0.4 15 ml/kg体重[3]。对照组开腹后仅翻动十二指肠及胰腺后关腹。术后6、24 h下腔静脉采血，离心取血清，-80℃冻存。迅速切取肾脏，一个置液氮冻存，一个甲醛固定。

2．检测指标和方法：血清淀粉酶、肌酐、尿素氮含量采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)检测。血清TNF-α检测按照ELISA试剂盒(武汉博士德公司)说明书操作。

胰腺、肾脏组织行常规病理学检查，肾脏病理损害分级标准参照文献[4]。

肾组织水通道蛋白1(aquqporin-1,AQP1)mRNA表达采用RT-PCR方法检测。应用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)抽提肾组织的总RNA，逆转录cDNA后PCR扩增。AQP1上游引物5′-TGGCTTGTCTGTGGCTCTTG-3′，下游引物5′-ATCAGCATCCAGGTCATACTCC-3′，扩增片段259 bp；内参β-actin上游引物5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′，扩增片段150 bp。PCR反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s， 35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，以AQP1与β-actin扩增片段的灰度值比值作为AQP1 mRNA相对表达量。

肾组织AQP1蛋白表达应用免疫组化染色法检测。镜下观察AQP1的表达，采用Imagepro plus数码医学图像分析系统，获取3个高倍视野的阳性染色面积的积分光密度值，取平均值表示蛋白表达量。

二、结果

1．血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α的变化：ANP组血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α水平均较对照组明显升高(P﹤0.01)；HES组较ANP组显著下降(P﹤0.01)，但仍显著高于对照组(P﹤0.01，表1)。

表1 各组血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α的变化

注：与对照组比较，aP<0.01；与ANP组比较，bP<0.01

2．胰腺、肾脏病理学改变：对照组胰腺和肾脏组织未见明显异常。ANP组胰腺肿大、出血坏死，大网膜、肠系膜、后腹膜上可见皂化斑，镜下见胰腺组织水肿明显，大片状出血、坏死灶，大量炎症细胞浸润，甚至形成脓肿，胰周脂肪坏死(图1a)；肾小球肿胀、严重淤血，间质水肿明显，少量炎症细胞浸润，肾小管片状水肿、变性，部分坏死，细胞界限模糊(图1b)。HES组胰腺和肾脏病理炎症改变较ANP组减轻，肾脏组织病理分级降低(表2)。

图1 ANP组6 h的胰腺(a) 、肾脏(b)病理改变(HE ×100)

组 别只数0级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级对照组6h88000 24h88000ANP组6h80242 24h80035HES组6h80431 24h80242

3．肾脏AQP1 mRNA表达的变化：对照组、ANP组和HES组6 h点的AQP1 mRNA表达量分别为0.696±0.037、0.395±0.027、0.662±0.027；24 h分别为0.699±0.039、0.299±0.016、0.531±0.013。组间比较相差均显著(P值均﹤0.05，图2)。

图2对照组(1)、ANP组(2)、HES组(3)肾脏AQP1 mRNA的表达

4．肾脏AQP1蛋白表达的变化：对照组、ANP组和HES组6 h的AQP1蛋白表达量分别为249804.2±54372.6、64971.0±21203.1、132176.5±19406.7；24 h分别为252320.4±48144.9、65268.7±21258.6、130403.8±15604.3。组间比较相差均显著(P值均﹤0.05，图3)。

图3对照组(a)、ANP组(b)、HES组(c)24 h时肾脏AQP1蛋白的表达(免疫组化 ×400)

讨论急性肾功能障碍是SAP常见的并发症之一，其机制为：(1)肾脏血流动力学的异常。SAP急性期毛细血管通透性增加，大量炎性渗液和组织液进入第三间隙，造成全身有效循环血量的严重不足，肾血流量减少，微循环灌注不足；(2)炎症介质、细胞因子的作用。SAP体内炎症介质和细胞因子激活后级联放大效应产生大量高浓度、有活性的炎症介质和细胞因子，直接作用损伤肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞；(3)大量炎性渗液形成的腹腔高压。由于大量炎性渗液和组织液渗入腹腔，使腹腔压力明显增高，腹腔高压影响肾脏的动脉血供和静脉回流，加剧了肾功能的损伤。其中肾脏微循环灌注不足被视为引发肾脏损害的恒定因素[5]。

AQP1在肾脏中主要分布于近曲小管和髓袢降支的顶质膜和侧膜上。它主要作用是重吸收肾小球滤液的80%～90%，对红细胞通过肾脏内髓高渗环境起保护作用。体外实验证明，AQP1缺失将降低近曲小管和髓袢降支细段渗透性，液体重吸收能力降低，逆流倍增系统受到破坏[6]。缺血造成的急性肾功能衰竭存在AQP1表达的下降[7]。本实验结果显示，ANP大鼠肾脏组织出现病理性改变，AQP1 mRNA和蛋白表达下调，表明AQP1在SAP肾功能损害中起重要作用。

HES 130/0.4可以提供稳定可靠的容量效应和持续灌注，快速增加组织氧分压，改善微循环，减少炎症反应，还具有防止和堵塞毛细血管渗漏作用[8]。有研究报告，HES 130/0.4有减轻脓毒血症引起的肺毛细血管渗漏和抑制炎症介质TNF-α的作用[9]。本实验结果显示，HES组大鼠血清TNF-α明显下降，肾脏AQP1的表达增加，推测HES 130/0.4可能通过抑制炎症介质TNF-α释放并增强肾AQP1的表达，从而改善ANP大鼠肾功能的障碍。

[1] Pupelis G.Renal failure in acute pancreatitis.Timing of dialysis and surgery.Przegl Lek，2000，57：29-31.

[2] 杨波，黄鹤光，陈大良，等.逆行性胰胆管注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型.福建医科大学学报，2002，36：71-72.

[3] Tian J，Lin X，Li YH，et al.Influence of hydroxyethyl starch on lipopolysaccharide-induced tissue nuclear factor kappa B activation and systemic TNF-alpha expression.Acta Anaesthesiol Scand，2005，49：1311-1317.

[4] 雷文章，韦靖江，沈文律，等.实验性坏死性胰腺炎多器官损害与内毒素血症的关系.中华实验外科杂志，1995，12：131-132.

[5] 王彩花，钱大可，唐训球.急性胰腺炎的肾损害49例.胃肠病学，1999，4：51.

[6] Chou CL，Knepper MA，Hoek AN，et al.Reduced water permeability and altered ultrastructure in thin descending limb of Henle in aquaprin-l null mice.J Clin Invest，1999，103：491-496.

[7] Gong H，Wang W，Kwon TH，et al.Reduced renal expression of AQP2，p-AQP2 and AQP3 in haemorrhagic shock-induced acute renal failure.Nephrol Dial Transplant，2003，18：2551-2559.

[8] Entholzner EK，Mielke LL，Calatzis AN，et al.Coagulation effects of a recently developed hydroxyethyl starch(HES130/0.4) compared to hydroxyethyl starches with higher molecular weight.Acta Anaesthesiol Scand，2O00，44：1116-1121.

[9] Feng X，Hu Y，Ding J，et al.Early treatment with hydroxyethyl starch 130/0.4 causes greater inhibition of pulmonary capillary leakage and inflammatory response than treatment instituted later in sepsis induced by cecal ligation and puncture in rats.Ann Clin Lab Sci，2007，37：49-56.

2009-07-28)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.021

福建省自然科学基金(2008J0086)

350001 福州，福建医科大学附属协和医院普外科

黄鹤光，Email:hhuang2@yahoo.com.cn