RP-HPLC同时测定珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量

丁林芬， 郭亚东， 吴兴德， 马银海

(1.昆明医学院药学院，云南昆明650031;2.昆明学院化学科学与技术系，云南昆明650031)

珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)为报春花科珍珠菜属植物，又名扯根菜，红根草等。全草入药，具有清热解毒、活血调经、利水消肿等功效［1］。黄酮类化合物是珍珠菜中的主要化学成分［2-3］，过去在含量研究方面主要采用紫外分光光度法测定黄酮的含量［4-5］，但同时测定珍珠菜中槲皮素和山柰酚含量的方法未见报道，本实验建立反相高效液相色谱法同时测定珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量测定方法，进一步完善了珍珠菜的质量控制体系。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 Agilent 1100 series高效液相色谱仪，包括四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，Agilent色谱工作站。

1.2 试剂 乙腈为色谱纯(美国Merk公司)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

1.3 材料 槲皮素对照品(自制，用面积归一化法测定其含量＞98%)，山柰酚对照品(自制，用面积归一化法测定其含量＞98%)。珍珠菜样品采自云南省大理市，由中国科学院昆明植物研究所李锡文教授鉴定为珍珠菜L.clethroides，标本现存于该所标本室(标本号2006-19)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相:乙腈-水(含0.4%的磷酸)，梯度洗脱(0～15 min，17∶83～40∶60)，流速:1 mL/min，检测波长:360 nm，柱温:40°C。在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱见图1。

2.2 对照品和供试品溶液的配制

图1 珍珠菜的高效液相色谱图

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取对照品槲皮素5.7 mg，山柰酚5.9 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。分别精密吸取贮备液各1 mL，置于100 mL量瓶中，混匀，制得浓度分别为0.005 7 mg/mL的槲皮素及0.005 9 mg/mL的山柰酚混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取珍珠菜粉末约1 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入70%甲醇50 mL，温度80°C，称定重量，热回流3 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足重量，摇匀，即得供试品溶液。进样前取适量溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积，以进样量X(μg)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，槲皮素及山柰酚的回归方程分别为:

结果表明槲皮素在0.005 7～0.114 μg范围内线性关系良好;山柰酚在0.005 9～0.118 μg范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 分别精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图，结果槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为0.85%，0.72%。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于0，2，4，6，8 h进样，记录色谱图，结果槲皮素和山柰酚峰面积的RSD分别为1.65%，0.88%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别测定槲皮素和山柰酚的含量，结果槲皮素和山柰酚含量的RSD分别为1.45%，1.79%，表明本方法重复性良好。

2.3.5 回收率试验取已知含量的珍珠菜粉末(每克含槲皮素56.5 μg，山柰酚29.2 μg)，共9份，分别加入相当于样品中槲皮素和山柰酚含量的80%，100%，120%的对照品溶液各3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样测定，以回归方程计算3种浓度的平均加样回收率，槲皮素的平均加样回收率为97.3%，RSD为1.12%(n=9)，山柰酚的平均加样回收率为97.2%，RSD为1.94%(n=9)。结果见表1。

2.4 样品含量测定 取不同批次的珍珠菜粉末1 g，共3批，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，记录槲皮素和山柰酚的峰面积，由线性方程计算各自含量，测定结果见表2。

3 讨论

3.1 样品处理方法的选择 本实验分别考察了提取溶剂，时间，温度及料液比等因素对珍珠菜中槲皮素和山柰酚提取率的影响，并进行了单因素实验。结果表明:在70%甲醇，1:50料液比，80°C热回流3 h的条件下，槲皮素和山柰酚的提取率最高。

3.2 流动相的选择 用乙腈-水二元系统进行等度洗脱，槲皮素和山柰酚的保留时间过长，改用梯度洗脱程序，保留时间缩短且峰形得到较大的改善。由于槲皮素和山柰酚的结构式中含有羟基，故在流动相中加入磷酸，从而使其峰形得到较好的改善。实验证明，在此条件下能得到较好的结果。

表1 槲皮素和山柰酚加样回收率测定结果(n=9)

表2 珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量(μg/g，n=3)

3.3 检测波长的选择 经紫外扫描，槲皮素和山柰酚在360 nm处有最大吸收，故本试验采用360 nm的检测波长对槲皮素和山柰酚的含量进行准确检测。

［1］卫生部中华本草编委会，国家中医药管理局.中华本草［M］.第6卷.上海:上海科学技术出版社，1999:96-98.

［2］邹海艳，屠鹏飞.珍珠菜黄酮类化合物的研究［J］.中国天然药物，2004，2(1):59-61.

［3］任风芝，郄建坤，屈会化，等.珍珠菜脂溶性部位的化学成分研究［J］.解放军药学学报，2001，17(4):178-180.

［4］唐丽华，徐向毅，薛振德，等.珍珠菜中黄酮类成分的分离和含量测定［J］.抗感染药学，2005，2(3):118-120.

［5］游本刚，唐丽华，刘扬.紫外分光光度法测定珍珠菜中总黄酮含量［J］.中国野生植物资源，2007，26(1):43-45.