野生与栽培地骨皮药材HPLC指纹图谱的研究

刘 伟， 郭 蕾， 崔永霞， 陈志红， 龚海燕

(河南中医学院分析测试中心，河南郑州450008)

地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥根皮［1］。具有凉血除蒸，清肺降火之功效，具有阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咯血、衄血［2］作用，地骨皮含东莨菪内酯，香草酸，甜菜碱等成分［3-4］，为临床常用中药。目前，关于地骨皮药材质量分析报道不多，本试验采用反相高效液相色谱，梯度洗脱，对采自河南，宁夏，甘肃等产地的14批野生和栽培地骨皮药材进行了指纹图谱分析研究，以期为进一步完善该药材的质量标准提供实验依据。

1 仪器、试剂和样品

DIONEX Summit系统高效液相色谱仪，FA2004A万分之一天平;实验所用甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。相似度评价软件:中国药典会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(A/B版)。所有地骨皮药材(见表1)均采自于河南等不同省份，其中栽培地骨皮生长年限均为3年，以上样品由河南中医学院药学院陈随清教授鉴定为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥根皮。

表1 地骨皮药材样品的来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取各批次地骨皮粉末(过四号筛)约2 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液35 mL，蒸干，加甲醇定容至5 mL，经微孔滤膜过滤器(0.45 μm)过滤，作为供试品溶液。

2.2 试验条件的考察

2.2.1 流动相的选择 本试验曾选用多种流动相梯度洗脱系统进行洗脱，首先选用了甲醇-水、乙腈-水不同比例变化的梯度洗脱，结果发现，甲醇-水作为流动相时，色谱峰分离效果比乙腈-水作为流动相峰的分离效果好，且基线较为平稳，但是个别峰的分离效果不佳，在水相中加入0.1%的磷酸来调节，结果发现色谱峰分离改善明显，各色谱峰的分离效果较好，最后确定流动相洗脱系统为甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)溶液梯度洗脱，并进行洗脱条件的优选，最后确定最佳梯度洗脱程序:流动相A:0～25 min，13% ～20%;25～60 min，20% ～22%，色谱图上各色谱峰分离良好，保留时间适中，峰形对称。

2.2.2 色谱柱选择 试验中共考察了3种不同厂家的色谱柱 Dikma Kromasil C18100A，AichromBond-AQ C18及 Agilent TC-C18(均为250 mm×4.6 mm，5 μm)3种型号色谱柱的分离效果，结果发现Dikma Kromasil C18100A，Agilent TC-C18色谱柱分离所得的色谱图有拖尾现象，且个别峰的分离度较差，而AichromBond-AQ C18色谱柱的分离效果较好，基线平稳，且峰形也较为对称，因此选择AichromBond-AQ C18色谱柱。

2.2.3 检测波长的选择 本试验采用二极管阵列紫外检测器作为检测器，首先在上述色谱条件下采用全波长扫描进行测定，并同时在200～400 nm下采集其三维色谱图，通过对三维色谱图在所有波长下的出峰的情况、基线的平稳程度，以及各成分的分离情况等综合考虑，最终选定检测波长为315 nm。

2.2.4 供试品溶液制备方法的选择 本试验曾考察了甲醇，80%甲醇，水，95%乙醇4种提取溶剂，结果发现水作为提取溶剂的样品溶液所得的供试品峰数较多，但是杂质也很多，很难使每个色谱峰完全分离，最重要的是所得色谱图特征性不明显;95%乙醇为提取溶剂的样品溶液所得色谱峰比80%甲醇和甲醇提取所得的样品溶液色谱峰少;80%甲醇和甲醇作为提取溶剂所得色谱峰差别不大，但80%甲醇提取色谱峰个别峰分离度较差，因此采用甲醇作为提取溶剂。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 色谱条件 AichromBond-AQ C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸水，按“2.2.1”项下选定的条件进行梯度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:25℃;检测波长:315 nm;记录时间:60 min;进样量10 μL。

2.3.2 方法学考察

2.3.2.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按照2.3.1项下色谱条件进样，连续进样5次，记录各共有峰保留时间和峰面积，以共有峰的3号峰作为内标准峰，结果显示，共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值的RSD值分别为0.08%～0.77%和0.40% ～2.11%，符合指纹图谱的要求，表明仪器精密度良好。

2.3.2.2 重复性试验 精密称取同一批样品5份，按照2.1项下方法制备供试品溶液，进样，记录各共有峰的保留时间和峰面积。以3号峰作为内标准峰，结果显示，共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值的RSD值分别为0.08%～0.86%和1.72% ～2.81%，符合指纹图谱要求，表明试验的重复性良好。

2.3.2.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液，在相同的条件下分别于0，3，6，9，12，15 h 测定结果，以3 号峰的保留时间和峰面积值作为参照，共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值的RSD值分别为0.02% ～0.33%和0.33% ～2.93%，符合指纹图谱要求，表明试液在15 h内稳定。

2.3.3 样品测定 取14批供试品，按2.1项下供试品制备方法制备并测定，样品色谱图见图1。以3号峰的保留时间为参照，共有峰的相对保留时间RSD值为0.31% ～0.91%，共有峰面积和大于总峰面积的90%，共有峰的相对峰面积见表2。

图1 地骨皮样品色谱图(2号:甘肃兰州栽培，8号峰为共有峰3号峰)

表2 各批次药材共有峰的相对峰面积

3 结果

3.1 地骨皮样品共有模式建立 以药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)”对上述14批地骨皮药材HPLC指纹图谱进行分析，建立了地骨皮药材的对照指纹图谱，确定了12个共有峰作为基本特征峰。指纹图谱匹配结果见图2。

3.2 指纹图谱相似度分析 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对上述14批药材的指纹图谱进行相似度的分析，相似度计算结果见表3。试验分析结果表明，相似度分析结果均在0.85以上。

图2 14批药材的指纹图谱

表3 相似度计算结果

4 讨论

4.1 从14批药材的整体看来，各样品共有峰的相对保留时间严格一致，各个共有峰的相对峰面积变化趋势也一致，其相似度在0.85以上，不同产地的地骨皮药材有比较好的一致性，并且通过方法学考查试验验证，本试验具有较好的精密度、稳定性和重现性。因此，该地骨皮指纹图谱具有专属性，可以作为地骨皮真伪和优劣鉴定的手段之一，对地骨皮药材进行质量控制。

4.2 本试验所用野生和栽培地骨皮药材均采自于全国各地，所得指纹图谱共有峰相对保留时间RSD值均小于1%，但是共有峰相对峰面积有一定差别，由图2可知，野生和栽培地骨皮化学成分种类差别不明显，但是其化学成分的含量却存在较大差异，全国不同区域，不同来源地骨皮的化学成分含量差异亦较为明显，这可能与各药材来源，产地的土壤气候条件、种植方法以及采集时间等因素有关。

4.3 本试验的14批地骨皮药材中，在检出限内未检测出东莨菪内酯、香草酸、肉桂酸等成分(东莨菪内酯、香草酸、肉桂酸对照品在标准对照色谱指纹图谱共有峰中未找出其归属)。受文献资料缺乏和仪器条件所限，试验未能给出部分色谱峰的有效成分归属，有待进一步研究。

［1］中国药典［S］.一部.2005:82.

［2］江苏新医学院《中药大辞典》编写组.中药大辞典:上册［M］.上海:上海人民出版社，1997:819.

［3］郑军义，赵万洲.地骨皮的化学与药理研究进展［J］.海峡药学，2008，20(5):62-65.

［4］周 洁，朱 伟.地骨皮的化学成分及药理研究进展［J］.山西中医，2008，24(2):47-48.