RP-HPLC法测定盐酸青藤碱PLGA纳米粒的包封率及载药量

侯鹏伟，王 东，范 娇，于 辉，彭海生，孙守丽(1.黑龙江省食品药品检验检测所，哈尔滨市

150012;2.哈尔滨医科大学大庆校区药学系，大庆市 163319;3，哈尔滨医科大学检验系，哈尔滨市 150081)

青藤碱是一种从防己科植物青风藤中提取出来的一种生物碱单体化合物［1］，一般用其盐酸盐。其原植物青风藤被用来治疗风湿性关节炎已超过一千年，通过药理学研究发现青藤碱具有抗炎、抗风湿［2］、免疫抑制［3，4］、以及抗心律失常［5］的作用。但盐酸青藤碱对光热不稳定，易分解，生物半衰期较短，且有致皮疹等不良反应［6］。纳米粒载药能降低药物的副作用，起到缓释控释的作用。我们采用乳化-溶剂挥发法，以聚合物PLGA为载体材料，制备盐酸青藤碱纳米载药颗粒［7］，为评价颗粒的质量，我们建立了简便快速、准确可靠的 RPHPLC分析方法，为评价该颗粒的包封率和载药量提供参考依据。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪及SPD-20A紫外检测器(shimadzu，Japan)，LC-SOLUTION 色谱工作站 (shimadzu，Japan)，FA25高速剪切乳化机(弗鲁克，上海)，盐酸青藤碱(批号MRHTG090513)(陕西森弗生物技术有限公司)，PLGA(50/50，30000)(山东省医疗器械工业研究所)HPLC级甲醇(DIKMA，USA)，HPLC级磷酸二氢钠二水合物(产品编号CAEQ-4-012929-0100)(CNW，German)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 纳米粒的制备

采用乳化-溶剂挥发法制备盐酸青藤碱纳米粒，首先将内水相(W1相，含有一定量的盐酸青藤碱的水溶液)在搅拌状态下(转速8 000 r·min-1)滴加到含有一定量 PLGA的二氯甲烷中(O相，1%span-80)，形成初乳。再将所得初乳于搅拌状态下加入外水相(W2相，含有一定量的 PVA和 tween-80)，转速10 000 r·min-1，形成复乳。挥发复乳中的有机溶剂，离心洗涤，冷冻干燥。保留上清液待分析［7］

2.2 溶液的制备

精密称取盐酸青藤碱适量，加水制成2.59 mg·mL-1的盐酸青藤碱储备液。

2.3 方法学考察

2.3.1 波长选择:精密量取盐酸青藤碱储备液适量，加水稀释至25.9 μg·mL-1，在200～300 nm范围内进行紫外扫描，结果在262 nm处有最大吸收，与文献报道［8，9］一致，因此波长选择为262 nm。

2.3.2 色谱条件:色谱柱:shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 -10 mmol·L-1NaH2PO4(38∶62);柱温为30℃;流速为1 mL·min-1;检测波长为262 nm;进样量为 10 μL。色谱图见图 1、2、3。

图1 阴性对照Fig 1 Negative control

图2 对照品溶液Fig 2 Control solution

图3 供试品溶液Fig 3 Sample solution

2.3.3 线性关系考察:分别精密量取盐酸青藤碱储备液适量，稀释至浓度为 0.51、5.18、12.95、25.90、51.80 μg·mL-1系列溶液。进样量为10 μL，各浓度平行进针五针。以浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，回归，得回归方程:y=8 890.6x+2 144.1，R2=0.999 9，线性范围为 0.5 ～50 μg·mL-1。

2.3.4 检测限及定量限试验:配制一定浓度的盐酸青藤碱溶液，依次稀释，信噪比为3∶1时的浓度为检测限，信噪比为10∶1时的浓度为定量限。结果:检测限为 18 ng·mL-1，定量限为 50 ng·mL-1。

2.3.5 稳定性试验:精密称取取盐酸青藤碱适量，稀释至浓度为 20.36 μg·mL-1，分别在 0、2、4、6、8、10 h 进样，进样量为10 μL，各进五针，计算得峰面积 RSD=0.79%。

2.3.6 精密度试验:精密称取盐酸青藤碱15.6 mg，加水溶解并稀释至15.6 μg·mL-1，1日内进样5次，连续3天，将所得峰面积代入回归方程计算其浓度，结果日内精密度和日间精密度分别为RSD=1.31%，RSD=1.59%。

2.3.7 回收率试验:按处方比例加入各种辅料进行混合，再分别加入盐酸青藤碱适量，配成 46.20、32.01、18.50 μg·mL-1高中低3个浓度3个样品进行测定，各浓度各进5针，所得峰面积代入方程计算其浓度分别为 45.16、31.05、18.01 μg·mL-1，回收率分别为97.74%、97.35%、97.00%，平均回收率为97.37%，RSD=0.38%。

2.4 包封率及载药量的测定

将制备纳米粒过程中所得上清液测量其体积V，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，再进样，所得峰面积代入回归方程，计算得上清液浓度C。再利用下述公式计算其包封率(entrapment efficiency，EE)和载药量(drug loading，DL)。EE=(M1-C·V)/M1;DL=(M1-C·V)/［(M1-C·V)+M2］。M1为制备纳米粒时加入青藤碱的质量，C为上清液的浓度，V为上清液的体积，M2为制备纳米粒时加入PLGA的质量。

3 讨论

本实验建立了盐酸青藤碱纳米粒的RP-HPLC分析方法，此方法溶剂和辅料对药物的测定无干扰，盐酸青藤碱在10 h内稳定，能准确快速的对其包封率和载药量进行分析。

在实验中曾尝试过以甲醇 -5 mmol·L-1Na2HPO4(55∶45)［10］，乙腈 -0.78%NaH2PO4(12∶88)［11］为流动相进行分析，发现前者呈弱碱性，超过所用色谱柱适应的 pH范围(2～7.5)，使用一段时间后会使色谱柱柱效降低，峰出现拖尾和肩峰;而后者分析灵敏度较低，也有一定程度的拖尾。二者在一定程度上均会影响分析效果。最后实验采用甲醇-10 mmol·L-1NaH2PO4(38∶62)为流动相，其具有分离度高，灵敏度强，峰形较好，可准确快速的测定盐酸青藤碱 PLGA纳米粒的包封率和载药量。

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