裸鼠原位膀胱癌放射性核素内照射治疗的实验研究

吴 光 侯建全

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，约占泌尿系统原发肿瘤的45%～70%，其中70%～80%为浅表性膀胱癌。当前对膀胱癌的治疗主要是经尿道肿瘤切除术辅以膀胱灌注化疗，降低肿瘤复发率及恶化率，但仍有约60%～80%的患者复发，其中10%～20%将发展成浸润性膀胱癌，此时患者需行膀胱全切术且预后极差，因此，寻求更新且有效的治疗方法，改善肿瘤患者的生存质量并尽可能保留膀胱，是当前亟待探索和解决的1个课题。我们前期实验发现[1]：125IUdR膀胱灌注可提高局部药物浓度，延长其在靶器官的滞留时间，并较少对周围组织的毒副作用。本实验着重探讨在裸鼠原位膀胱癌动物模型125IUdR治疗的有效性及安全性，为临床试验提供前期工作。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌T24细胞株，为T3期膀胱癌，购于中科院上海生物细胞研究所；BALB/c雌性裸鼠48只，由中国科学院上海实验动物中心提供，4～5周龄，体重为(15±3)g；Na125Ⅰ由中国原子能科学研究院提供，UdR为Sigma公司产品；丝裂霉素(MMC)由浙江海正药业股份有限公司提供；氨甲喋呤(MTX)由浙江万马药业有限公司提供；Caspase-3购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物模型的制备

参照前期研究[2]，将对数生长期T24膀胱癌细胞株调整浓度为2×107/ml，1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，暴露膀胱，自尿道插入22 G静脉留置针套管，针芯轻划膀胱左侧壁4～5次，PBS液冲洗膀胱3～4次后立即灌注T24细胞悬液0.1 ml(细胞数约2×106个)，至少保留1 h，并逐层缝合手术切口，每天观察行为习惯、营养状况及膀胱区有无异常肿块。

1.3 125IUdR的制备

参照前期研究[1]合成125IUdR，将合成的125IUdR溶液和生理盐水配制成18.5 KBq/10 μl的125IUdR溶液以备用。

1.4 实验治疗分组

种植后1周将36只实验裸鼠随机分成4组，即对照组、MMC组、125IUdR组和联合组，每组9只，对照组不予任何处理，其余3组分别予1 mg/ml的丝裂霉素0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml联合氨甲喋呤(膀胱灌注前1 h腹腔注射，注射量为20 mg/kg)膀胱灌注，每5天1次，共4次；实验前3天至实验当天，125IUdR组及联合组裸鼠每日灌入碘化钾溶液1次，以封闭甲状腺，第28天每组处死裸鼠3只，解剖膀胱肿瘤并称重，进一步行病理学检查。其余实验裸鼠进行为期60天的生存分析。

1.5 细胞周期分析

第2次膀胱灌注后24 h，对照组、125IUdR组与联合组各随机取3只裸鼠，采用颈椎脱臼法处死，每只切取直径约3 mm新鲜膀胱肿瘤组织剪碎，经300目/mm2滤网过滤制成单细胞悬液，70%冰乙醇固定2 h后以PBS液漂洗3遍，加入碘化丙啶(PI)，于4℃黑暗处静置30 min后流式细胞仪分析细胞周期。

1.6 实时定量PCR检测p21基因的mRNA表达

Trizol一步法提取RNA，并用6-随机引物逆转录成cDNA。

p21 正义链，5’-ATGTC AGAAC CGGCT GGGGA T-3’；反义链，5’-GGGCT TTCCT CTTGG AGAAG AT-3’。内参基因GAPDH正义链，5’- GCAAGTTCAACGGCACAG-3’；反义链，5’- GCCAGTAGACTCCACGAC-3’。

real-time PCR反应体系：5×Buffer 5 μl，Mg2+0.4 μl，10 mmol的dNTP 0.75 μl，10 mmol的正义引物0.75 μl，10 mmol的反义引物 0.75 μl，Tag酶 0.3 μl，EVA green 1 μl，模板cDNA 2 μl，加H2O至25 μl。

PCR反应 条件：95℃ 变性5 min；95℃ 变性20 s；58℃ 退火20 s；72℃ 延伸20 s，共45个循环；80℃ 读板；72℃ 再延伸5 min。反应完成后，将产物于4℃保存。长期保存温度应是-20℃。

通过2-△△CT方法进行计算目的基因和内参基因的相对拷贝数。

1.7 Caspase-3蛋白表达的检测

免疫组化染色采用SP法(Streptavidin-biotin immunoperoxidase method)，Caspase-3为兔抗人IgG。Caspase-3蛋白染色结果判定标准：按照每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计分，行半定量分析。阳性细胞所占比例判断：无着色为0分，1/3以下着色为1分，1/3～2/3着色为2分，2/3以上着色为3分。着色深浅：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项相乘0分为-，1～3分为+，4～6分为++，7～9分为+++；(+)为低表达，(++)为中度表达，(+++)为高表达。

1.8 统计学处理

实验结果数据应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析或χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察

膀胱灌注后第2～3周时对照组耻骨上区可触及膀胱质地变硬，轻轻挤压可见明显肉眼血尿，3周内各组裸鼠均未见采食饮水、行为习惯的改变；第3～4周时，对照组部分裸鼠出现消瘦、采食饮水及活动量减少，部分裸鼠死于恶病质；MMC组和125IUdR组部分裸鼠出现采食饮水及活动减少；联合组裸鼠未见明显变化。

2.2 实验裸鼠膀胱肿瘤重量测定

3个治疗组裸鼠膀胱肿瘤重量分别为(41.583±4.945)mg、(42.825±2.590)mg和(31.075±3.931)mg，均较对照组轻(P<0.05)，3个治疗组抑瘤率分别为33.45%、31.46%和50.27%，其中联合组低于MMC组和125IUdR组(P<0.05)，见图1。

图1 各组实验裸鼠平均膀胱肿瘤重量比较

2.3 病理检查

HE染色结果显示：对照组膀胱腔内充满肿瘤细胞，排列紊乱，异型性明显，并见肿瘤细胞浸润肌层；MMC组、125IUdR组膀胱腔内覆盖肿瘤细胞数十层，并可见膀胱腔存在，部分肿瘤细胞浸润肌层，膀胱腔内部分区域可见肿瘤坏死灶；联合组膀胱腔内覆盖数层肿瘤细胞，膀胱腔清晰可见，膀胱腔内可见大量的肿瘤坏死灶。

2.4 流式细胞仪分析(FCM)

流式细胞仪分析测定各组肿瘤细胞的G1期、S期百分比和凋亡指数(AI)。结果显示：联合组肿瘤细胞S期百分比明显降低，肿瘤细胞大量停滞在G0/G1期，凋亡指数明显大于对照组和125IUdR组，并见明显的凋亡峰。125IUdR组肿瘤细胞S期百分比低于对照组，且凋亡指数大于后者，见表1。

表1 各组细胞周期分布及凋亡指数比较

注：△△为联合组与对照组比较，P<0.05；△为125IUdR组与对照组比较，P<0.05

2.5 p21基因mRNA的表达

Real-time PCR检测p21基因mRNA表达结果显示：3个治疗组其表达水平均明显高于对照组(P<0.05)，其中联合组高于MMC组和125IUdR组(P<0.05)；后两者之间差异无明显统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 各组肿瘤细胞p21基因相对拷贝数比较

2.6 Caspase-3蛋白染色

对照组肿瘤细胞中caspase-3蛋白呈低表达(评分为1.33分)，MMC组、125IUdR组和联合组caspase-3蛋白分别呈中度表达、中度表达和高表达(评分分别为4.67、4.67和9分)，均明显高于对照组，其中联合组高于MMC组和125IUdR组，而后两者之间差异无明显统计学意义(P>0.05)。

2.7 生存分析

对照组裸鼠平均生存时间为29.33天，而MMC组、125IUdR组和联合组分别为35.33、36.67和44.67天，均大于对照组(P<0.01)，其中MMC组和125IUdR组平均生存时间较联合组短(P<0.01)，MMC组和125IUdR组平均生存时间差异无明显统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

在辐射致死效应中，基因组DNA(genomic DNA)是细胞内最重要的靶点。125Ⅰ标记的脱氧尿苷(125IUdR)是脱氧胸苷(TdR)类似物，能特异性掺入处于S期细胞的DNA，引起DNA双链断裂和细胞死亡，属于细胞周期特异性放射性药物。膀胱是一理想的药物灌注囊腔，且膀胱癌多起源于尿路上皮表层，故尤其适合放射性核素标记的药物使用，且局部应用125IUdR可以维持较高的药物浓度，又可减轻全身毒副作用。

由于肿瘤细胞呈异质性增殖，某一特定时刻所有肿瘤细胞处于不同的细胞周期，国外学者研究发现，氨甲喋呤能明显抑制胸苷酸合成酶(TS)，阻断内源性脱氧胸苷的合成，并耗尽体内的脱氧胸苷酸储备，而125IUdR通过补救途径磷酸化后能替代DNA中的脱氧胸苷酸。Kassis等[3]联合应用氨甲喋呤和125IUdR进行研究，氨甲喋呤能阻断125IUdR在体内的降解，延长125IUdR治疗时间，结果发现体外暴露于氨甲喋呤与125IUdR的肿瘤细胞可以增加125IUdR的摄取及125IUdR在DNA中的插入，提高肿瘤组织与非肿瘤组织放射活性比值；单独鞘内应用氨甲喋呤疗效较差，单独应用125IUdR疗效较好，两者联合应用疗效有明显提高。本实验研究发现，在实验期内联合组裸鼠采食饮水、行为习惯等方面无明显改变，而实验后期125IUdR组部分裸鼠出现采食饮水减少，活动量逐渐减少；联合组裸鼠平均膀胱重量明显小于125IUdR组，且平均生存时间大于后者。说明氨甲喋呤联合125IUdR的疗效明显优于125IUdR单独治疗的疗效。

本实验中我们应用流式细胞仪对实验裸鼠膀胱肿瘤细胞的周期进行了测定，结果显示联合组、125IUdR组肿瘤细胞的S期百分比明显低于对照组，联合组出现明显的凋亡峰，表明125IUdR俄歇电子内照射治疗后主要使肿瘤细胞周期G1、S期检查点的功能受到干扰，出现G1期阻滞，S期细胞比例下降，氨甲喋呤可增强125IUdR对膀胱肿瘤细胞的凋亡效应。

p21基因是最广泛的酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，p21蛋白广泛地结合并抑制Cyclin-cdk复合物(细胞周期素依赖周期素的激酶复合物)，抑制cdk激酶的活性，阻止细胞通过G1/S期关卡，使细胞停留在G1期。刘新等[4]研究发现p21基因表达缺失可使膀胱肿瘤细胞增殖活跃；Kasasaki等[5]研究显示p21基因是1种肿瘤抑制基因，在DNA损伤剂引起的细胞凋亡中起重要作用；Chen等[6]研究发现p21基因与膀胱癌的分级相关。本试验结果显示3个治疗组肿瘤细胞p21基因mRNA表达水平明显高于对照组，125IUdR明显增加了p21基因的表达水平，而其中联合组表达水平高于MMC组和125IUdR组，表明氨甲喋呤与125IUdR对膀胱肿瘤细胞p21基因的表达有联合促进效应。

Caspase-3是caspase家族中的一员，在参与凋亡的多种caspase中，caspase-3是凋亡执行阶段的主要效应酶之一，在细胞凋亡过程中处于核心位置，它的激活发生在凋亡细胞出现特征性形态改变之前，是凋亡过程的早期事件，caspase-3活性增强，不仅可以表明细胞凋亡的存在，还可表明细胞凋亡的发生是caspase-3依赖性的。caspase-3的表达表明细胞必定死亡，因此caspase-3被称为死亡蛋白[7]。本试验caspase-3蛋白染色结果显示，对照组肿瘤细胞caspase-3蛋白呈低表达，明显低于其余3个治疗组的表达；联合组呈高表达；而MMC组和125IUdR组呈中度表达，与联合组之间的差异有统计学意义。表明125IUdR可促进肿瘤细胞的凋亡，而氨甲喋呤与125IUdR有协同效应。

总之，膀胱内灌注125IUdR对实验裸鼠膀胱癌的治疗安全有效，125IUdR能选择性的杀伤DNA合成期S期的肿瘤细胞，显著抑制膀胱癌细胞的增殖，干扰膀胱癌细胞的DNA合成，为125IUdR的临床应用提供了理论依据。

[1] 侯建全,周守军,朱 然,等.大鼠膀胱内灌注125Ⅰ脱氧尿嘧啶核苷的药代动力学及组织分布〔J〕.中华实验外科杂志,2006,23(1):90.

[2] 杨慎敏,侯建全,温端改,等.原位膀胱癌动物模型的建立和应用〔J〕.癌症,2006,26(4):52.

[3] Kassis AI,Dahman BA,Adalstein SJ.In vivo therapy of neoplastic meningitis with methotrexate and 5-[125I]iodo-2-deoxyuridine〔J〕.Acta Oncologica,2000,39(6):731.

[4] 刘 新,杨春明,孙志熙,等.膀胱癌复发与p53、p21WAF-1/CIP1和细胞周期素E基因表达的相关性研究〔J〕.中华实验外科杂志,2002,19(6):495.

[5] Kasasaki T,Tomita Y,Bilim V,et al.Abrogation of apoptosis induced by DNA-damaging agent in human bladder cancer cell lines with p21/WAF1/CIP1 and/or p53 gene alterations 〔J〕.International Journal of Cancer,1996,68(4):501.

[6] Chen WC,Wu HC,Hsu CD,et al.p21 gene codon 31 polymorphism is associated with bladder cancer〔J〕.Urologic Oncology,2002,7(2):63.

[7] Howard Y.Proteases for cell suicide:functions and regulation of caspases〔J〕.Microbiol Mol Biol Rev,2000,64(4):821.