气相色谱-质谱法检测豆粉中的三聚氰胺

王 维 徐 颖 张凤娟 王海新 刘丽莉 刘 巍

(佳木斯出入境检验检疫局，佳木斯 154002)

三聚氰胺(Melamine)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的氮杂环有机化工原料，简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精。其化学性质呈弱碱性(pH 8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等均能形成三聚氰胺盐。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。三聚氰胺进入人体后，会发生取代反应(水解)，生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，造成结石。2007年的宠物饲料事件导致宠物死亡和2008年国内发生奶粉中添加三聚氰胺导致婴幼儿死亡的事件，都是不法厂商非法添加三聚氰胺引起的。为了保障国人健康以及为我国进出口贸易提供强有力的技术支持，不断开发和完善食品中有害物质的残留分析技术具有重要的现实意义。

目前我国尚无豆粉类食品中三聚氰胺的检测标准，相关的检测方法鲜有报道，有人用非衍生化-气相色谱串级质谱(GC-MS-MS)法测定豆粉中的三聚氰胺，但设备过于昂贵，不易普及[1]。笔者采用气相色谱-质谱法检测三聚氰胺，建立了豆粉类食品中三聚氰胺定性和定量的确证方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪：GC/MS 2010PLUS型，配EI化学源以及化学工作站，日本岛津公司；

电子天平：BS224型，德国赛多利斯公司；

超声波清洗器：KQ-700DN型，昆山市超声波仪器有限公司；

密理博纯水机：RIOS-3型，美国密理博公司；

离心机：Z300型，德国Hermle公司；

固相萃取装置：ASE-12型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

旋涡混均器、均浆机：美国IKA公司 ；

MCX阳离子交换柱：60 mg,3 mL，美国Waters公司；

氮吹仪: KL512型，北京康林科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯；

吡啶：优级纯；

氨水：25%～28%；

三氯乙酸溶液：10 g/L；

乙酸锌溶液：22 g/L；

甲醇溶液：200 mL甲醇加入800 mL水；

氨水甲醇溶液：将5 mL氨水，用甲醇溶解定容至100 mL；

衍生化试剂：N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(体积比为99∶1)；

氦气：纯度大于等于99.999%；

三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%；

三聚氰胺标准储备液：1 mg/mL，准确称取100 mg(精确到0.1 mg)三聚氰胺标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，于4℃避光保存；

三聚氰胺标准溶液：10 μg/mL，准确吸取三聚氰胺标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，于4℃冰箱内储存，有效期3个月；

除另有规定，实验用试剂为分析纯，实验用水符合GB/T 6682一级水。

1.2 样品处理

(1)样品前处理

取1～1.5 g(精确到0.000 1 g)豆粉放入50 mL玻璃离心管中，准确加入2 mL乙酸锌溶液，加入8 mL三氯乙酸，涡旋震荡混匀，超声波提取15 min,取出放入离心机，以6 000 r/min离心5 min。[2]

(2)净化

分别用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol盐酸溶液活化混合型阳离子交换柱(MCX)，准确移取5 mL离心液上柱，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱[3]。整个固相萃取过程流速不超过 1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干。

(2)衍生化

取上述氮气吹干残留物，加入400 μL的吡啶和200 μL衍生化试剂，混匀，于70℃反应30 min后[3]，供GC-MS法定量检测或确证。

1.3 仪器条件

(1)色谱条件

色谱柱：RTX-5MS 5%苯基95%二甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；流速：1.0 mL/min；程序升温：140℃保持2 min，以 20℃/min的速率升温至 280℃，保持2 min；接口温度：230℃；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；

(2)质谱条件

电离方式：电子轰击电离(EI)；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；扫描模式：选择离子扫描(SIM)；定性离子为m/z99、171、327、342，定量离子为m/z327。

在上述条件下，三聚氰胺标准样品的总离子流图和质谱图分别见图1、图2。

图1 三聚氰胺标准样品的总离子流图

图2 三聚氰胺标准样品的质谱图

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

根据豆粉样品蛋白质、脂肪、蔗糖含量高的特点，样品提取净化方法参照固相基质分散法，用乙酸锌沉淀蛋白质，用阳离子交换柱过滤糖分和脂肪，整个过程样品用量小，只转移一次,仅50 mL离心管需要清洗。该法满足目前对三聚氰胺分析前处理过程方便、快捷、高效、低成本及污染小的要求。通过实验发现，三聚氰胺在酸性条件下溶解性比较好，和常用的3 mL甲醇、3 mL水活化混合型阳离子交换柱相比，该法利用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol盐酸溶液活化混合型阳离子交换柱。在0.05 μg/mL添加水平上用3 mL甲醇、3 mL水活化柱回收率为83.5%，而用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol盐酸活化柱回收率为85.6%。

2.2 标准曲线和检出限

配制浓度为0.05、0.10、0.15、0.25、0.50 μg/mL系列三聚氰胺标准溶液，进行GC-MS分析。根据标准溶液和待测样品SIM离子流图的峰面积，外标法定量分析。以三聚氰胺选择离子的峰面积A对质量浓度c(μg/mL)绘制标准曲线，得回归方程为A=5 634c-9.5，相关系数r=0.993。以标准品的保留时间和检测离子定性，待测样品的丰度比与标准品的丰度比相差不大于20%。

2.3 方法的回收率及精密度

采用标准加入法，对不含三聚氰胺的豆粉样品准确加入三聚氰胺标准溶液，制备添加浓度为0.05、0.10 μg/mL的样品各5份，按上述方法进行提取和净化，并进行GC-MS分析，回收率和精密度，见表1。由表1可见，添加回收率为85.6%、95.7%，相对偏差小于10%。

表1 回收率及精密度试验结果(n=5)

3 结论

采用微波萃取、固相萃取处理样品，用GC-MS定性和定量分析，有效地解决了高蛋白、高脂肪、高糖分、基质干扰严重的豆粉类样品的前处理问题，该法可作为豆粉类食品中三聚氰胺的检验方法。

[1] 李东刚,鞠福龙,刘晓玲，等.非衍生化-气相色谱串级质谱(GC-MS-MS)法测定豆粉中的三聚氰胺[J].大豆科技，2009(1)：37-39,42.

[2] GB 22388-2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺的测定[S].

[3] NY/T 1372-2007 饲料中三聚氰胺的测定[S].