改性大豆磷脂对豆粉结构和理化性质的影响

王喜波，梁亚茹，杨 朔，郭增旺，江连洲，范志军，王中江，滕 飞,*，李 杨,3,4,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，黑龙江 佳木斯 154000；3.哈尔滨市食品产业研究院，黑龙江 哈尔滨 150030；4.康奈尔大学，纽约州 伊萨卡 14850）

豆粉含有丰富的蛋白质、大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆卵磷脂等营养和功能性成分，被认为是一种高度易消化蛋白质来源，其传统生产工艺是由大豆经浸泡、制浆、热处理、调配、均质后喷雾干燥制成[1-2]。随着豆粉种类和功能性需求的增加，出现了经生物酶解后得到的改性生物解离富肽豆粉[3]。目前，豆粉类产品的速溶性和特征性风味是此领域的研究重点[4]。研究表明，生物酶解、添加改性大豆磷脂、添加还原剂等处理手段可改善豆乳粉的溶解性和豆腥味[5]。王玲等[6]对豆奶进行适当的生物解离后，经喷雾干燥制成豆奶粉，其溶解性、耐热性和豆腥味等方面均有显著改善。潘丽[7]研究发现由于大豆磷脂亲水亲油平衡值（hydrophilic lipophilic balance，HLB）较低，不适宜制备水包油型乳化剂，限制了大豆磷脂的应用范围。但大豆磷脂经物理、化学或者酶法改性后，改变了HLB值，改善了磷脂的乳化特性，提高了磷脂在水中的分散特性[8]。改性后磷脂的乳化稳定性大大提高，被广泛用于食品、医药、饲料、化妆品、皮革、纺织等领域[9-10]。在豆浆中加入改性大豆磷脂，喷雾干燥后得到的豆粉中含有亲水性强的改性大豆磷脂，豆粉更易吸湿溶解，速溶性更好，使豆粉有更加柔软的口感[11-12]。

生物酶法是一种从大豆中提取油脂和蛋白质的环保型技术，且具有条件温和、工艺简单、耗能少、安全性高、易掌控等优点，得到的产品质量好，深受消费者喜爱[13-16]。但在提取油脂时，会产生大量的水解液，其中富含蛋白质[17-18]，目前关于此水解液的综合高附加值利用，鲜有报道。

本研究以生物解离酶法制得的大豆水解液为原料制备豆粉，探讨不同添加量的改性大豆磷脂对豆粉结构（粒度和比表面积、扫描电镜结构、粒径分布、光学显微镜变化）、理化（分散性、润湿性、沉淀系数、堆积密度、干物质溶解指数（dry matter solubility index，DSI）、乳化活性、乳化稳定性）和感官特性的影响，从而为生物酶法水解液的开发利用和改性大豆磷脂在豆粉行业的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆（品种：黑农48） 哈尔滨比优特超市；碱性蛋白酶 丹麦诺维信公司；麦芽糊精（食品级）广州成硕生化试剂有限公司；改性大豆磷脂 郑州华安食品添加剂有限公司；葵花籽油 中粮佳悦（天津）有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、盐酸、氢氧化钠、石油醚 哈尔滨四叶草生物科技有限公司；所用基础试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Allegra 64R台式高速冷冻离心机 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；DC-500A型高速多功能粉碎机浙江武义鼎藏日用金属制品厂；PHSJ-4A型实验室pH计上海雷磁公司；DK-98型电热恒温水浴锅 常州恒隆仪器有限公司；ZDDN-II自动型凯氏定氮仪 广州沪瑞明仪器有限公司；磁力搅拌器 广州仪科实验仪器有限公司；FA2004B电子分析天平 上海方瑞仪器有限公司；BL-6000Y喷雾干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；索氏抽提器 上海那艾精密仪器有限公司；S-3400N扫描电镜 日本日立公司；U182/U1S光学显微镜奥林巴斯（中国）有限公司；Zetasizer Nano-ZS90光散射粒径分析仪 英国Malvern公司；JW-BK200A多功能双站全自动比表面及孔径分析仪 北京精微高博有限公司；紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解离豆粉的制备

参考Li Li等[18]的方法。将大豆粉碎过40 目筛，取200 g过筛后的粉体，按料液比1∶6（g/mL）加入蒸馏水，搅拌均匀后放入55 ℃水浴锅内，保持pH值为9.0，添加2.4 L 0.5 g/100 mL碱性蛋白酶溶液，搅拌酶解2 h，酶解结束后，用1 mol/L HCl溶液调节pH值至7，沸水浴灭酶5 min，灭酶后的混合液于4 500 r/min、4 ℃离心20 min，离心后弃上层油相及下层固体，保留中层水解液作为实验原料。取500 mL大豆水解液，加入0.4 g/100 mL的麦芽糊精搅拌均匀，然后分别加入0%、0.3%、0.6%和0.9%（m/m）的改性大豆磷脂，搅拌均匀，经喷雾干燥制得豆粉，喷雾干燥机的进口温度为160 ℃，出口温度为90 ℃[19]。

1.3.2 豆粉基本组分的测定

水分含量测定根据GB 5009.3ü2016《食品中水分的测定》[20]的方法；灰分含量测定根据GB 5009.4ü

2016《食品中灰分的测定》[21]的方法；蛋白质含量测定根据GB 5009.5ü2016《食品中蛋白质的测定》[22]的方法；脂肪含量测定根据GB 5009.6ü2016《食品中脂肪的测定》[23]的方法。

1.3.3 豆粉的结构指标测定

1.3.3.1 粒度及比表面积测定

参考郭增旺等[24]的方法，利用激光粒度测定仪和双通道全自动比表面积分析仪测定豆粉粒度和比表面积。

1.3.3.2 扫描电镜观察

参考Muttakin等[12]的方法并略作修改。称取0.1 g样品，将其固定在碳带和铝短柱上并在真空下涂覆铂-铅（Pt-Pb），于5 kV、放大倍数3 000的条件下观察豆粉微观结构图像。

1.3.3.3 粒径分布测定

采用Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析仪分别检测豆粉溶液的粒径分布规律。1.3.3.4 光学显微镜观察

通过光学显微镜分别对不同添加量改性大豆磷脂经喷雾干燥工艺制备的豆粉进行观察。称取0.2 g豆粉溶于100 mL去离子水中，用玻璃棒充分搅拌，吸取配制好的豆粉溶液于载玻片上，放大倍数40的条件下放到显微镜下进行观察。

1.3.4 豆粉理化指标的测定

1.3.4.1 润湿性

参考李黎等[25]的方法并略作修改，称取1 g豆粉，烧杯中放50 ℃去离子水50 mL，从豆粉放入烧杯中开始计时，记录豆粉完全浸润的时间，称为润湿时间。

1.3.4.2 分散性

称取1 g豆粉，放入装有50 mL去离子水的烧杯中，用磁力搅拌器以转速600 r/min搅拌，豆粉完全分散于去离子水中的时间，称为分散时间。

1.3.4.3 堆积密度

参考赵巧丽[19]的方法并略作修改，将豆粉置于称量纸中完全转入10 mL量筒中，称量10 mL豆粉的质量，并计算出其堆积密度，堆积密度越大，豆粉性质越好。

1.3.4.4 DSI

参照张根生等[26]的方法，称取5 g豆粉，放入50 mL烧杯中，再加入70 ℃蒸馏水30 mL，用恒温磁力搅拌器搅拌10 min，使豆粉充分溶解成豆乳。将豆乳转入50 mL容量瓶中，待冷却后定容至50 mL，摇匀。取25 mL豆乳，放入离心管中，3 000 r/min离心10 min。用蒸馏水洗涤沉淀2～3 次，将沉淀以及洗涤液全部转入铝盒中，放入105 ℃烘箱中烘干沉淀至恒定质量，通过测定溶解质量描述其溶解性，DSI值越大溶解性越好，DSI值按式（1）计算：

式中：M为豆粉的总质量/g；m为沉淀烘干后质量/g；

1.3.4.5 沉淀指数

称取2 g样品于50 mL烧杯中，加入18 mL 60 ℃蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌15 min，然后吸取样液2 mL于10 mL量筒中，静置30 min，读取沉淀体积，重复实验。沉淀指数按式（2）计算：

式中：Y为沉淀指数；A为两次测定沉淀毫升数的平均值/mL。

1.3.4.6 豆粉乳化活性及乳化稳定性

参考Molina[27]和Tang Chuanhe[28]等的方法并略微修改，取一定体积的豆粉溶液，加入同体积的葵花籽油，以10 000 r/min速率搅拌1 min，用体积分数0.1%的SDS溶液稀释到一定倍数，再用紫外分光光度计在波长500 nm处测定吸光度，SDS溶液作空白，计算乳化活性指数。静置30 min后测定吸光度，计算其乳化稳定性，公式如下：

式中：C为乳化液形成前豆粉水溶液中豆粉质量浓度/（g/mL）；Φ为乳化液中油相体积分数/%；A0为0 min时的吸光度；A30为30 min时的吸光度。

1.3.5 豆粉的感官指标检测

参考GB/T 18738ü2006《速溶豆粉和豆奶粉》[29]制作感官指标评价标准（表1）和感官评定。

表1 速溶豆粉的感官指标Table 1 Sensory quality indexes of instant soybean fl our

1.4 统计分析

实验进行3 次平行，采用Origin 9.0软件分析数据并作图。利用SPSS Statistics 22软件对数据进行差异显著性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 改性大豆磷脂对豆粉基本组成的影响

表2 豆粉的基本组分质量分数Table 2 Proximinate composition of soybean fl our%

由表2可知，随着改性大豆磷脂质量分数的提高，豆粉的基本成分没有显著性变化，且各组理化指标均符合GB/T 18738ü2006。这表明加入改性大豆磷脂并不会显著影响豆粉的基本成分组成。

2.2 改性大豆磷脂对豆粉粒度与比表面积的影响

表3 改性大豆磷脂对豆粉的粒度与表面积影响Table 3 Effect of modified soybean phospholipids on the particle size and specific surface area of soybean fl our

由表3可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，随着改性大豆磷脂添加量的增大，颗粒的平均粒径先减小后增大，比表面积先增大后减小。当添加改性大豆磷脂的质量分数为0.6%时，豆粉颗粒的平均粒径最小、比表面积最大。这可能是因为低浓度磷脂与蛋白的复合不能形成稳定的空间位阻，不足以产生电荷表面斥力[30]，而随着磷脂添加量的增加，蛋白表面负电荷数量增加且蛋白间的分子斥力增强[31]，使溶液的液体体积变小进而降低了喷雾干燥后的豆粉粒径，但改性大豆磷脂添加量过高时，会引起乳液界面上磷脂分子和蛋白分子间相互竞争，降低溶液的稳定性使之发生聚集现象，导致干燥后的粒径增大。这表明添加改性大豆磷脂可以改变豆粉的平均粒径和比表面积。

2.3 改性大豆磷脂对豆粉微观结构的影响

图1 改性大豆磷脂对豆粉微观结构的影响（×3 000）Fig. 1 Effect of modified soybean phospholipids on the microstructure of soybean fl our (× 3 000)

由图1可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，添加改性大豆磷脂后均能引起豆粉颗粒变化；随着改性大豆磷脂添加量的增加，豆粉颗粒的大小呈现先降低后升高的趋势，且质量分数为0.6%时，豆粉的颗粒形态较小且以瘪状颗粒为主，分布较均匀密集。孟旭[32]研究发现，喷雾干燥时，磷脂和蛋白质在液滴表面形成了致密的膜，随着水分的蒸发，液滴体积变小，由于溶液中蛋白质含量高，相互作用较强烈，在液滴颗粒内部无法形成较大的孔，表面膜向内收缩；随着干燥的进行，溶液液滴中水分下降到临界值，液滴水分含量下降，表面磷脂和蛋白质形成的膜致密性和钢性程度也不断增加，随着液滴水分不断蒸发，液滴表面膜收缩速度较慢，液滴内部收缩较快，因此，颗粒形成了瘪状结构。这表明，适当添加改性大豆磷脂后，能减少豆粉的颗粒大小，由球状颗粒转变为瘪状颗粒，增大豆粉颗粒的比表面积，改善其微观形态。

2.4 改性大豆磷脂对豆粉溶解后的粒径分布影响

图2 改性大豆磷脂对豆粉溶解后粒径分布的影响Fig. 2 Effect of modified soybean phospholipids on particle size distribution of soybean fl our solution

由图2可知，随着改性大豆磷脂添加量的增加，豆粉溶液的粒径分布宽度呈现逐渐降低的趋势，粒径大小呈现先减小后增大的趋势，且在改性大豆磷脂质量分数为0.6%时，粒径分布宽度最窄、粒径最小且只有1 个单峰。Li Yang等[33]通过对磷脂和蛋白复合的纳米乳液研究表明，溶液粒径分布越窄，溶液中的液滴越均一，其稳定性越好。这可能是由于适当的小分子改性大豆磷脂与水解液中蛋白相结合后，会使干燥后的豆粉颗粒的亲水基团增多，提高粉体的亲水能力，降低界面张力，并且提高溶解后的乳液之间的分子间斥力，使之粒径降低，分布更加均匀，但过多的改性大豆磷脂和水解液中蛋白复合，使豆粉溶解后在乳液界面发生磷脂分子和蛋白相互竞争的现象，导致液滴颗粒增大，出现聚集

现象[31]，从而导致豆粉溶解后粒径增大。这表明添加适量的改性大豆磷脂，可以改变经喷雾干燥得到的豆粉溶解后的粒径分布，并改善其稳定性。

2.5 改性大豆磷脂对豆粉溶液的影响

图3 改性大豆磷脂对豆粉溶液显微图像的影响（×40）Fig. 3 Effect of modified soy phospholipid on microscopic image of soybean fl our solution (× 40)

从图3可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，添加改性大豆磷脂的豆粉溶液在光学显微镜下观察到液滴尺寸较小、分布较均匀、聚集现象不明显，且添加改性大豆磷脂质量分数为0.6%的豆粉溶液液滴尺寸小分布均匀，几乎无聚集现象，这和粒径分布结果一致。改性大豆磷脂可以和豆粉中蛋白表面疏水区域结合，从而增加豆粉蛋白颗粒表面负电性，颗粒间较强的静电斥力作用促使豆粉颗粒分散水溶液中而免于聚集，另一方面磷脂的亲水尾部增强了豆粉中蛋白与水的相互作用，促进了乳液初始阶段形成高密度的小而无聚集的颗粒，提高了乳液的稳定性[31,34]。因此，随着改性大豆磷脂添加量的增加，溶液液滴分布更加均匀、液滴粒径变小，但改性大豆磷脂的添加量过高时会导致磷脂分子和蛋白分子在乳化界面的竞争现象，引起液滴聚集现象。这表明添加适当的改性大豆磷脂可以改善豆粉在溶液中的分散情况和聚集现象，并且提高豆粉溶液的稳定性。

2.6 豆粉功能性指标分析

2.6.1 改性大豆磷脂对豆粉分散性、润湿性、沉淀系数的影响

图4 改性大豆磷脂对豆粉分散性、润湿性、沉淀系数的影响Fig. 4 Effect of modified soybean phospholipids on the dispersibility,wettability and precipitation coefficient of soybean fl our

由图4可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，随着改性大豆磷脂添加量的增加，豆粉的分散性、润湿性、沉淀指数呈现先降低后升高的趋势，且在添加改性大豆磷脂的质量分数为0.6%时，豆粉的分散性、润湿性、沉淀指数最佳。这是因为改性大豆磷脂能镶嵌到豆粉蛋白疏水结构内，降低豆粉蛋白质的等电点，增强表面负电荷强度和颗粒间相互排斥力，进而影响豆粉溶解后的胶体性质，改善豆粉的溶解性和润湿性[31,35]。

2.6.2 改性大豆磷脂对豆粉堆积密度的影响

图5 改性大豆磷脂对豆粉堆积密度的影响Fig. 5 Effect of modified soybean phospholipids on bulk density of soybean fl our

由图5可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，随着改性磷脂添加量的增加，豆粉的堆积密度呈先上升后下降的趋势，且在添加改性大豆磷脂质量分数为0.6%时，豆粉的堆积密度最高。由表3可知，添加改性大豆磷脂后可以降低豆粉颗粒的平均粒径，并且豆粉颗粒间的聚集性减弱，粉块变小或无粉块出现[19]，从而改变豆粉的堆积密度。这表明添加改性大豆磷脂通过影响豆粉颗粒大小以及粒径分布提高了豆粉的流动性，进而影响了豆粉的堆积密度。

2.6.3 改性大豆磷脂对豆粉DSI的影响

图6 改性大豆磷脂对豆粉DSI的影响Fig. 6 Effect of modified soybean phospholipids on DSI of soybean fl our

由图6可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，随着改性大豆磷脂添加量的增加，豆粉DSI呈现先上升后下降的趋势，且当添加改性大豆磷脂的质量分数为0.6%时，豆粉DSI最大，表明此时豆粉的溶解性最好。这可能是由于添加改性大豆磷脂后水解液中蛋白质表面负电性增强，分子间斥力增大，使得水解液中蛋白颗粒不易发生沉降，因而水解液中蛋白质的可溶性氮含量增强，复合磷脂的水解液喷雾干燥成豆粉后，其粉体速溶性增强。梁歧等[11]研究表明将改性磷脂直接添加到料液中可使经喷雾干燥得到的豆粉溶解度增加，吸水性增强，容重增大，速溶性明显改善。这表明添加改性大豆磷脂可以提高豆粉的溶解性。

2.6.4 豆粉乳化活性及乳化稳定性分析

图7 改性大豆磷脂对豆粉乳化活性和乳化稳定性的影响Fig. 7 Effect of modified soybean phospholipids on emulsifying activity and emulsion stability of soybean fl our

由图7可知，与未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，随着改性大豆磷脂添加量的增加，豆粉乳液的乳化活性指数和乳化稳定性呈先升高后降低的趋势，且当添加改性大豆磷脂质量分数为0.6%时，豆粉溶液的乳化活性指数和乳化稳定性值最高。这可能是由于磷脂可以改变蛋白的表面活性，对蛋白结构和表面电荷进行修饰，甚至将蛋白结合到磷脂分子形成的胶束和囊泡中，从而改变豆粉的理化性质，并且磷脂和蛋白的相互作用在稳定乳浊液方面有协同促进的作用。因此复合适量的磷脂可以使豆粉中蛋白质分子的界面张力降低，促进乳液乳化能力的升高，这与Maruyama等[36]的研究一致。但由于磷脂和豆粉中的蛋白都是两亲分子，当磷脂添加量过高时，会导致在乳液界面发生磷脂和大豆蛋白分子进行相互竞争的现象，引起乳液稳定性的降低，从而导致乳化能力的降低[31]。

2.7 改性大豆磷脂对豆粉感官指标的影响

表4 改性大豆磷脂对豆粉的感官指标的影响Table 4 Effect of modified soybean phospholipids on sensory quality indexes of soybean fl our

由表4可知，添加改性大豆磷脂的豆粉感官检验结果符合GB/T 18738ü2006的相应标准，且由图4、6可知，添加0.6%的改性大豆磷脂豆粉的润湿性、分散性、DSI较正常豆粉有显著改善。

3 结 论

以生物酶法制油得到的大豆水解液为原料制得豆粉，探讨不同添加量的改性大豆磷脂对豆粉结构、理化和感官特性的影响。结果表明，当添加0.6%改性大豆磷脂时，豆粉颗粒平均粒径较小，比表面积较大，微观结构颗粒较小且有干瘪状颗粒，豆粉溶液粒径分布宽度较窄溶液均匀，液滴分散均匀且溶液稳定，这表明添加改性大豆磷脂可以显著影响豆粉的结构特性；添加0.6%改性大豆磷脂的豆粉分散时间和润湿时间分别为27.5 s和45 s，沉淀系数为0.094，积密度为0.556 g/mL，DSI为82.15%，较未添加改性大豆磷脂的豆粉相比，润湿和分散时间减少了24.5 s和30 s，沉淀系数减小了0.008，堆积密度减小了0.16 g/mL，DSI提高了12.87%，这表明添加0.6%改性大豆磷脂显著改善了豆粉的理化性质；感官评价结果表明，将改性大豆磷脂与生物酶法制油大豆水解液混合，经喷雾干燥技术制得的豆粉感官评定符合国家标准。这表明以生物酶法水解液为原料，添加0.6%的改性大豆磷脂制得的豆粉符合国家标准，该研究为生物酶法水解液的开发利用和改性大豆磷脂在豆粉行业的生产应用提供理论基础。