菠菜叶绿素的提取及叶绿素铜钠盐的制备*

陈小全,田坤新,邵辉莹,翟 虎

(泰山医学院化学与化学工程学院，山东 泰安 271000)

食用色素[1]是重要的食品添加剂，分为合成色素和天然色素两大类;与合成色素相比，天然色素最大的优点是安全性较高，色调柔和、自然，且不少具有较高的营养价值和药理作用，有利于人类的健康，但对光、热、pH及氧化还原剂的敏感性较高，溶解度较小，色素浓度较低。叶绿素铜钠盐是以富含叶绿素的天然植物为原料，经过萃取精制加工所得的叶绿素的衍生物。本品为黄绿色至墨绿色粉末，易溶于水，略溶于乙醇和氯仿，溶液透明无沉淀。主要用做医药、日用化工、食品、除臭等工业的原料菠菜[2-4]中含有叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等多种天然色素。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂，也是食用绿色色素，可用于糕点、饮料水等中，添加于胶姆糖中还可消除口臭。胡萝卜素的三种异构体中β-胡萝卜素具有维生素A的生理活性，可代替维生素A使用，也可以为食品工业的食用色素使用，最新研究报道，β-胡萝卜素还用防癌功能。由此可见，菠菜色素有广泛的用途，对于色素的提取与分离就具有现实意义。

超声波[5,6]辅助提取技术是近年来广泛应用于天然植物提取领域的一种最新的较为成熟的手段。所以，超声波辅助提取菠菜色素具有很高的研究价值，本文主要研究在不同的提取剂，提取温度，提取时间，料液比，超声波辐射功率，辐射时间，相同功耗等条件下提取菠菜色素，确定最佳的提取条件，并研究菠菜叶绿素铜钠盐的制备工艺。

1 仪器与试剂

溶剂A、溶剂B、氢氧化钠、硫酸铜，乙醇，丙酮，石油醚，四氯化碳，正丁醇，苯甲酸，蔗糖，均为AR级。732型可见分光光度计(上海第三仪器厂)，比色管，超声波清洗器(DS2060型、KQ-250DB型)，分析天平，研钵，移液管(若干)，分液漏斗，蒸馏设备，胶头滴管(若干)，玻璃棒，烧杯(若干)，锥形瓶(若干)，铁架台，等。

2 实验方法

2.1 提取剂的选择

取乙醇、丙酮、石油醚、正丁醇各50 ml于锥形瓶中，分别加入5.00 g菠菜叶，在室温条件下，用DS2060型超声波清洗器处理30 min。取0.5 ml提取液用乙醇稀释定容到25 ml，在λmax=430 nm处用732型可见分光光度计测其吸光度A，如下表所示：

表1 提取剂对提取效果的影响( 用 A 值表示, 下同)

从测量结果可以看出：以乙醇的提取效果最好,其余依次为丙酮、正丁醇、石油醚。但用丙酮或者正丁醇作溶剂时,延长提取时间或提高提取温度,一样能达到较好的提取效果。考虑溶剂因素，本研究选用乙醇作浸提剂优化。

2.2 料液比的选择

称取2.00 g，3～10 mm新鲜、干净菠菜叶于锥形瓶中，分别加入6 ml、8 ml、10 ml、12 ml、14 ml乙醇，在室温条件下，用KQ-250DB型超声波清洗器处理30 min。取0.5 ml提取液用乙醇稀释定容到25 ml，在λmax=430 nm处用732型可见分光光度计测其吸光度A，如下表所示：

表2 料液比对提取效果的影响

由以上数据可知，选择料液比为1∶5。

2.3 提取温度的选择

取2.00 g，3～10 mm新鲜、干净菠菜叶于锥形瓶中，加入10 ml乙醇，分别 在 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃下，用KQ-250DB型超声波清洗器经过功率为 250 W 的超声波处理 30 min 后, 取0.5 ml提取液用乙醇稀释定容到50 ml，在λmax=430 nm处用732型可见分光光度计测其吸光度A，如下表所示：

表3 温度T(℃)对提取剂提取效果的影响

从数据可知，随温度的增大，提取效果提高，但考虑到能耗，选择50℃为提取温度。

2.4 超声波提取时间的选择

称取2.00 g，3～10 mm新鲜、干净菠菜叶于锥形瓶中，加入10 ml乙醇提取剂，在50℃处恒温，用KQ-250DB型超声波清洗器经过功率为 250 W 的超声波分别处理15 min、30 min、45 min、60 min、75 min。取0.5 ml提取液用乙醇稀释定容到25 ml，在λmax=430 nm处用732型可见分光光度计测其吸光度A，如下表所示：

表4 超声波处理时间t(min)对提取效果的影响

从以上数据可知，60 min的超声作用时间为宜。

2.5 超声波功率的选择

称取2.00 g，3～10 mm新鲜、干净菠菜叶于锥形瓶中，加入10 ml乙醇提取剂，在50℃处恒温，用KQ-250DB型超声波清洗器(额定功率为250 w)经过功率分别为150 W、175 W、200 W、225 W、250 W的超声波处理60 min后，取0.5 ml提取液用乙醇稀释定容到25 ml，在λmax=430 nm处用732型可见分光光度计测其吸光度A，如下表所示：

表5 超声波功率P(W)对提取效果的影响

根据吸光度与功率的数据，考虑到效率，选择200 W为提取功率。

2.6 菠菜叶绿素铜钠盐的制备

2.6.1实验步骤和方法

叶绿素的提取及皂化过程:通过正交试验探讨皂化条件,结果见表6。

表6 皂化反应的正交试验

在烧瓶中加入提取的叶绿素,再按正交表中的配比加入溶剂A、溶剂B,在皂化温度下搅拌30 min,使叶绿素充分溶解,滴入NaOH溶液,在400 r/min下搅拌反应45 min。反应结束后加入溶剂A进行萃取,然后用溶剂A洗涤3次。

根据正交试验,得到最佳条件为:溶剂总体积和菠菜叶的重量比为4∶1(ml/g),溶剂A体积和/溶剂B体积比为4∶1,加碱量为6 g,反应温度为45℃。铜代过程主要考察了硫酸铜的加入量,以及铜代反应的pH值对反应收率的影响。硫酸铜的加入量分别为理论量的1.1、1.0和0.9倍;碱铜代时pH=12～13,酸铜代时pH=4～5。铜代过程:在洗涤过的皂化液中,加入所需量的硫酸铜溶液,分别在45℃、搅拌转速400 r/min、和碱性条件(pH=12～13)或酸性条件(pH=4～5)下铜代反应45 min。反应结束后,冷却静置,真空抽滤得到粗叶绿素铜钠盐溶液,结果见表7。

表7 铜代实验结果

酸化结晶过程:粗叶绿素铜钠盐溶液,用HCl调pH值至2.2左右,分别加入一定量的结晶诱导剂,搅拌15 min,于25℃静置60 min,真空抽滤,得到粗叶绿素铜酸固体。若加入量少,叶绿素不能完全溶解,对反应不利。至于两种溶剂的体积比,因为叶绿素在其中都能溶解,所以它对反应影响小。表7表明碱性铜代优于酸性铜代,所以铜代工艺采用碱性铜代方式,在碱性铜代中,又以理论摩尔比值的0.9倍铜加入量为好。酸化结晶过程铜代反应结束后,产物实际上是以叶绿素铜钠盐的形式存在于铜代液中,酸化结晶过程主要目的是通过酸化和结晶的方法,将产物以叶绿素铜酸(固体结晶)的方式从铜代液中析出,便于后面的产物精制。过程的酸化终点pH值一般应控制在2.0左右,否则产物析出不完全,影响得率;但是酸化终点pH值也不能太低,本研究酸化终点pH值控制在2.0～2.2,调节溶液的pH后,产物还不能顺利地从溶液中析出,还必需加入结晶诱导剂,促进产物析出,结晶诱导剂的加量对得率有一定的影响。

3 结果与结论

从实验结果可以看出，就菠菜叶绿素而言，当超声波辐射时间、溶剂、物料比一定时，辐射功率越高，溶出的叶绿素越多；而相同辐射功率的情况下，辐射时间的越多，溶出的红色素也越多。因此超声波的使用能够降低叶绿素的提取时间并使提取效果有所提高。考虑到色素的热稳定性及功耗，辐射时间及功率也不是越大越好。超声波作用下菠菜叶绿素的提取应以乙醇为提取液，料液比1∶5、辐射功率200 W、超声时间60 min、提取温度 50℃的条件为宜；而整个过程叶绿素铜钠盐的产率可达52.6%。

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