高葡萄糖钳夹技术应用初探*

杨 杰，张 建，魏岱林，闫晓云，冯永军，吴平霞

(泰山医学院附属泰山医院内分泌科，山东 泰安 271000)

众所周知，胰岛β细胞分泌胰岛素功能缺陷是决定血糖水平变化的最为重要的病理生理因素之一，是发生2型糖尿病的关键环节之一。因此，评估胰岛β细胞功能对于研究糖尿病的发生、发展、预后以及指导制定个体化的治疗方案等均具有十分重要的意义。目前，评估胰岛β细胞功能的方法众多，其中，高葡萄糖钳夹技术是经典和公认的方法[1]，它能全面反映胰岛β细胞功能，观察胰岛素双相分泌功能以及胰岛β细胞功能葡萄糖刺激的敏感性。本试验旨在初步研究高葡萄糖钳夹技术的建立。

1 对象与方法

1.1对象 12例正常人，男6例，女6例，平均年龄(33±5.8)岁，男女受试者年龄及体重指数均无显著差异，均排除糖尿病、糖耐量减退及肝、肾疾病，均未使用影响胰岛素分泌及胰岛素敏感性的药物。试验前3天，受试者每日碳水化合物饮食不少于250 g，试验前，告知受试者试验的性质、目的、注意事项及可能产生的不良反应，并填写知情同意书。

1.2方法

1.2.1用品准备 快速葡萄糖测定仪(德国BIOSEN)、输液泵(法国OPTIMA PT)、自制恒温箱、静脉留置针Y型、直型留置针(德国贝朗)、肝素帽3个、消毒液、无菌纱布、输液器、透明敷贴、5 ml注射器、1 ml注射器、50 ml注射器、胰岛素检测试剂盒(泰格科信增强化学发光免疫分析法)、10%和50%葡萄糖、0.9%氯化钠。

1.2.2所有受试对象空腹12 h，早晨8:00到实验室，测定身高、体重、腰围及臀围，并排空小便后仰卧。实验室要求环境整洁、温湿度适宜(温度25℃、湿度60%)，备好床单元、输液架、将输液泵、恒温箱分别固定在床的两侧连接好。后配制20%葡萄糖，取10%葡萄糖500 ml一袋，抽出125 ml弃之，加入50%葡萄糖125 ml，同法再配制另一袋。分别在受试者双前臂静脉或正中静脉穿刺并留置穿刺针，以0.9%NaCl液维持通道，以备抽血及输注20%的葡萄糖。试验过程要求受试者在清醒安静状态下进行，总时间为3小时。

1.2.3高葡萄糖钳夹试验 在试验开始前30 min、15 min、0 min分别抽取基础血样，并将一侧前臂置于恒温仪中(温度50 ℃)以保证静脉血动脉化。另一侧静脉开始输注20%葡萄糖，具体输注速率按照DeFronzo经典钳夹技术[2]的体表面积经验值(表1)和实际操作中测定的血糖值来调整。高葡萄糖钳夹的目标值是在正常空腹血糖的基础上通过输注葡萄糖使血糖浓度快速升高到13 mmol/L左右，并维持此高糖平台2小时以上。葡萄糖的输注可分为2个阶段[2]：(1)初始剂量期，又称血糖快速升高阶段，为钳夹试验开始至第14分钟，此期内血糖快速升至目标值。每2 min取血测血糖(葡萄糖氧化酶法，德国内卡公司的快速血糖检测仪)，0～10 min每2 min取血分离血清待测胰岛素。(2)维持剂量期，又称高糖平台维持阶段，为钳夹试验15～150 min，此期需将血糖稳定在目标值左右。期间每5 min取血测血糖，并根据血糖值调节葡萄糖输注率。每10 min取血分离血清待测胰岛素。所有血样置于-80℃冰箱保存至测定。

1.2.4收集试验期间的尿标本，测定尿糖浓度，以校正葡萄糖代谢率。

1.3计算方法和指标

1.3.1双相胰岛素(Ins)分泌 (1)第1时相Ins分泌(1Ph)：为高糖钳夹试验前10 min，即2、4、6、8、10 min的Ins浓度的总和[3]。(2)第2时相Ins分泌(2Ph)：为高糖钳夹中20～150 min的平均Ins浓度。

1.3.2最大Ins分泌量 为钳夹试验中最后的30 min(即120～150 min)的平均Ins浓度。

1.3.3葡萄糖代谢率(M，mg·kg-1·min-1)钳夹过程中葡萄糖输注率(INF)减去空间校正值(SC)和尿糖值(UC)，即M=INF-SC-UC ，SC=(G2-G1)×0.095×18，其中G2、G1分别表示调整后及前的血糖值(mmol/L)。

1.3.4Ins敏感性指数(ISI) 为钳夹试验中最后30 min(即120～150 min)的平均葡萄糖代谢率(M)与平均胰岛素浓度(I)的比值×100，即ISI=M/I×100[2]。

表1 高葡萄糖钳夹0～14 min葡萄糖输注率

2 结 果

2.1高葡萄糖钳夹技术的建立

2.1.1高糖平台的建立 血浆葡萄糖水平基础状态为(5.06±0.08) mmol/L，高糖钳夹开始后血糖快速升高，平均在第8分钟达到高糖目标水平，即(13.16±0.28) mmol/L。在以后的钳夹过程中，血糖持续稳定在此高糖平台，平均为(12.95±0.15) mmol/L。在整个过程中，血糖变化相对较小，变异系数为4.6%(图1)。

2.1.2Ins的双相分泌与最大Ins分泌量 (1)1Ph：钳夹开始前，基础Ins值平均为(6.56±0.98) mU/L，高葡萄糖钳夹开始后，血胰岛素浓度迅速升高，在4～8 min出现第一个峰值，达(73.82±5.63) mU/L，随后渐下降，20～30 min最低，为(48.63±3.91) mU/L，1Ph为(256±17.89) mU/L。(2)2Ph：20～150 min平均Ins浓度为(90.52±7.1) mU/L。(3)最大Ins分泌量，即钳夹120～150 min的平均Ins浓度为(116.27±11.34) mU/L。

2.1.3葡萄糖代谢率和ISI 钳夹开始后葡萄糖输注率从最大速率在14 min内逐渐下降，在20～30 min最低，后葡萄糖输注率缓慢平稳升高，至120～150 min平稳，波动较小。由计算所得M120～150 min平均为(16.3±0.12) mg·kg-1·min-1。钳夹过程中尿糖平均值为(0.29±0.05) mg·kg-1·min-1。ISI为(16.25±2.02 )mg·kg-1·min-1/mU/L。

图1 高葡萄糖钳夹血浆葡萄糖曲线

图2 高葡萄糖钳夹血浆胰岛素水平

3 讨 论

胰岛β细胞功能非常复杂，包括胰岛β细胞感知胰岛素分泌的能力、胰岛素合成和分泌以及β细胞分化、增殖、凋亡及再生等。目前，胰岛β细胞功能有狭义和广义之分。狭义定义指β细胞在葡萄糖刺激下分泌胰岛素以维持血糖水平稳定的功能，可用于评定与药物治疗无关的β 细胞胰岛素分泌功能。广义定义则指β细胞在葡萄糖及非葡萄糖因素(精氨酸、胰高血糖素、化学药物等)刺激下分泌胰岛素来维持血糖水平稳定的能力，用于评定与药物治疗有关的β 细胞胰岛素分泌功能，例如改善胰岛素敏感性，刺激胰岛素的分泌，纠正高血糖的毒性等是否引起β细胞功能变化及变化的机制[4]。

目前，评估胰岛β细胞功能比较困难，存在许多矛盾和争论，因此，临床和科研中有很多方法评估胰岛β细胞功能，包括胰岛素脉冲样分泌模式的检测和胰岛β细胞分泌刺激试验(葡萄糖刺激试验和非葡萄糖刺激试验)。葡萄糖刺激试验主要有高葡萄糖钳夹技术、正葡萄糖高胰岛素钳夹技术、静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)结合数学模型分析技术以及临床常用的口服糖耐量试验(OGTT)等；非糖刺激试验主要有精氨酸试验及胰高血糖素试验。

其中，高葡萄糖钳夹技术是经典和公认的精确性最高的评价胰岛β细胞功能的方法。该方法是由Rubin Andres首先建立，DeFronzo继而应用于人类胰岛β细胞功能评估的。其原理是通过持续输注外源性葡萄糖，将血糖控制在高糖目标值，观察β细胞对葡萄糖的反应,从而评价胰岛β细胞功能。在持续的高糖刺激下，Ins的分泌呈现双相峰。第1时相指输入葡萄糖10 min内，Ins的分泌快速上升，峰值多在4～8 min。在葡萄糖的刺激下，β细胞内β颗粒迅速释放胰岛素，使短期内达到峰值，主要反映β细胞的储备功能。随后外源性葡萄糖持续输注使血糖维持在较高水平，故β细胞继续合成和分泌Ins，第2时相分泌逐渐明显，此相Ins浓度升高相对缓慢，且与高糖持续时间保持一致。由于高糖钳夹使不同个体血糖升高的水平相同，且可完整地观察Ins的双相分泌，故能精确地评价胰岛β细胞储备和分泌功能。

成功建立高葡萄糖钳夹技术需符合下列要求[5]：(1)在指定时间内(14 min)形成机体高葡萄糖状态并维持试验所需的高糖平台；(2)在维持高糖平台期间，每5 min检测一次血糖，其变异系数不能超过5%；(3)出现双相Ins分泌形态。

本研究严格按照DeFronzo的经典技术进行。观察结果如下：(1)高糖钳夹开始后血糖快速升高，平均在第8 min达到高糖目标水平，即(13.16±0.28) mmol/L。血糖持续稳定在此高糖平台，平均为(12.95±0.15) mmol/L。(2)钳夹过程中每5 min测血糖，变异系数为4.6%。(3)高葡萄糖钳夹开始后，血胰岛素浓度迅速升高，在4～8 min出现第一个峰值，达(73.82±5.63) mU/L，1Ph为(256±17.89) mU/L，2Ph为(90.52±7.1) mU/L，最大Ins分泌量为(116.27±11.34) mU/L。上述结果提示高葡萄糖钳夹技术已经成功建立，在高糖刺激下，能够真实反映胰岛素一相和二相分泌，了解胰岛β细胞储备和分泌功能，评估β细胞功能。

通过建立高葡萄糖钳夹技术，略谈几点体会和注意事项：(1)一定严格筛选正常受试者，排除如肥胖、血尿酸增高等可能影响胰岛素双相分泌的因素。(2)由于本试验需持续2小时以上，试验过程中受试者出现排尿等可能影响血糖波动的因素，注意及时调整胰岛素输注率，避免血糖过度波动。(3)恒温箱调节温度为50℃，使静脉血动脉化，避免温度过高或过低，影响结果。(4)由于每例受试者需要采血37次，前14 min每2 min采血一次，故采血时既要严格无菌操作，准确及时，又要防止溶血等可能影响结果的因素。(5)高糖持续刺激至150 min试验结束时，体内血胰岛素浓度仍然保持在较高水平，此时，停止高葡萄糖输注，受试者在停止输注约半小时后会出现低血糖症状，为避免发生，应告知受试者试验结束时立即进食。

综上所述，高葡萄糖钳夹技术能了解Ins的双相分泌，能发现早期及潜在的β细胞功能减退，能获得β细胞最大的胰岛素分泌量[6]。本研究成功建立正常受试者高葡萄糖钳夹技术，为下一步研究更广泛人群的β细胞功能，如长期大量饮酒者、肥胖者、IGT、糖尿病患者提供了技术保障和支持[7]。

[1] Stumvoll M， Gerich J. Clinical features of insulin resistance and beta cell dynfunction and the relationship to type 2 diabetes[J] . Clin Lab Med，2001，21(6):31.

[2] DeFronzo RA， Tobin JD， Andres R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance[J]. Am J Physiol, 1979,237(3):E214-223.

[3] Chiu KC， Cohan P， Lee NP， et al. insulin sensitivity differs among ethnic groups with a compensatory response in beta cell function[J].Diabetes Care，2000，23(2):1353-1355.

[4] 严励,何扬.胰岛β细胞分泌功能评估指标的比较[J].中华内分泌代谢杂志,2005,21(8): 503-506.

[5] Dariush E . In praise of the hyperglycemic clamp， a method for assessment of beta cell sensitivity and insulin resistance[J].Diabetes Care，1996,19(4):278-286.

[6] 朱敏,贾伟平,包玉倩,等.高葡萄糖钳夹技术的建立[J].中华糖尿病杂志,2004,12(6):23-27.

[7] 王玉中,孙素中,向国艳,等.高葡萄糖钳夹技术评价肥胖和2型糖尿病者胰岛β细胞功能及胰岛素敏感性[J].现代预防杂志,2009,14(5):2706-2709.