LHR、Caspase-3、和Bcl-2在围着床期小鼠输卵管上皮的表达*

石运芝,刘 迅,刘 敏,杨 东

( 1. 泰山医学院组织学与胚胎学教研室，山东 泰安 271000；2. 泰山医学院附属泰山医院妇科，山东 泰安 271000； 3.泰安市中医院制剂科，山东 泰安 271000；)

输卵管是输送配子、受精和早期胚胎发育的重要场所。深入研究围着床期(peri-implantation)输卵管特异分子的表达调控，是揭示输卵管与受精卵和早期胚胎的关系，以及阐明输卵管妊娠机制的基础。

细胞凋亡在女性生殖活动中所起的重要作用已得到公认，Xu JS等曾报道，人输卵管细胞可维持与其共培养的卵裂期鼠胚线粒体膜电位，抑制Caspase的活性，促进鼠胚发育[1]。黄体生成素受体(luteinizing hormone receptor，LHR)属于G蛋白耦联受体家族，通过与黄体生成素(luteinizing hormone，LH)结合，在整个生殖生理过程中起着十分重要的作用[2-4]。但是有关凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2和LHR在小鼠输卵管中的表达情况以及它们之间是否具有相关性等，国内外报道甚少，且研究结果也颇一致。

鉴于此，我们以正常成熟雌性昆明小鼠为研究对象，通过免疫组织化学技术研究了围着床期输卵管上皮中LHR、Caspase-3和Bcl-2的分布和变化规律，并对其可能的生物学作用和调节机制加以探讨，以期为生殖调控的理论体系提供新的资料。

1 材料和方法

1.1 标本制备

健康成熟雌性昆明小鼠28只，体重25～30 g，随机分为4组：第1组为动情期组，第2组为妊娠第1 d组，第3组为妊娠第4 d组，第4组为妊娠第6 d组，每组7只。正常有生育能力的成熟雄鼠10只。实验动物由山东省实验动物研究所提供。动情周期的划分以阴道细胞涂片确定：动情期细胞全部是无核角化上皮细胞，无白细胞。妊娠确定：于傍晚将雌性小鼠与雄性小鼠2∶1合笼，次日晨查见阴栓者定为妊娠第1 d。

1.2 SABC法免疫组织化学染色

将各组小鼠脱颈处死，立即剖腹，解剖镜下分离出输卵管，PBS冲洗后，投入4%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡连续切片，切片厚度为6 μm。切片经脱蜡入水，3%H2O2室温作用10 min，蒸馏水洗；微波抗原修复2次；5%BSA封闭液，室温20 min；分别滴加兔抗小鼠LHR(1∶200)、兔抗小鼠Caspase-3(1∶200)和兔抗小鼠Bcl-2(1∶200)，37 ℃孵育2 h；生物素化羊抗兔IgG，37 ℃温浴30 min；SABC复合物，37 ℃温浴30 min；DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。每一组均设阴性对照，以PBS代替一抗。一抗和SABC免疫组织化学试剂盒，均购于武汉博士德生物工程公司。

1.3 结果判定及分析

每个标本随机选取6张切片，光学显微镜下，每张切片随机观察3个视野，阳性部位呈棕黄色，根据着色深浅，将着色强度分为强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)和阴性(-)。并将图像输入Image Pro Plus图像分析系统(泰山医学院基础研究所)，分别测得各实验组输卵管上皮中阳性细胞的平均光密度(OD值)，并绘出直条图，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 输卵管上皮中LHR免疫组化染色结果及图像分析

各组LHR阳性着色主要见于输卵管上皮细胞游离缘，高倍镜下可见着色部位主要位于细胞表面的纤毛或微绒毛，部分上皮细胞内亦有阳性着色。在孕1 d，输卵管的上皮细胞呈强阳性(+++)着色(图1)。于孕4 d，上皮着色稍减弱(++)，但仍显著强于动情期和孕6 d组(图2、3、4)。

2.2 输卵管上皮中Caspase-3免疫组化染色结果及图像分析

光镜下观察，Caspase-3免疫阳性产物主要分布于输卵管上皮细胞的胞浆内。输卵管上皮细胞的着色在动情期组最强(+++)(图5)，在孕早期各组的着色呈现逐渐减弱的趋势，孕4 d降至最低，至孕6 d着色又有所增强(图6、7、8)。

2.3 输卵管上皮中Bcl-2免疫组化染色结果及图像分析

Bcl-2阳性着色部位与Caspase-3相仿，主要分布于输卵管上皮细胞的胞浆内。而且Bcl-2的着色与LHR有相似的变化规律，即孕1 d组上皮着色最深(+++)(图9)，孕4 d组上皮着色减弱(++)，至孕6 d时着色(+)已低于动情期的水平(++)(图10、11)。

图1 孕1 d输卵管LHR阳性着色。标尺示100 μm

图2 孕4 d输卵管LHR阳性着色。标尺示100 μm

图3 孕6 d输卵管LHR阳性着色。 标尺示100 μm

图4 各组小鼠输卵管上皮LHR水平的变化

图5 动情期输卵管Caspase-3阳性着色。×200

图6 孕4 d输卵管Caspase-3阳性着色。×200

图7 孕6 d输卵管Caspase-3阳性着色。×200

图8 各组小鼠输卵管上皮Caspase-3水平的变化

图9 孕1 d输卵管Bcl-2阳性着色。×200

图10 孕6 d输卵管Bcl-2阳性着色。×200

图11 各组小鼠输卵管上皮Bcl-2水平的变化

3 讨 论

小鼠输卵管分伞部、壶腹部、峡部和间质部。由于部位不同，黏膜皱襞高低、多少均不同。在输卵管峡部横断面上略呈十字样的狭小管腔，至壶腹部时，在横切面上管腔充满了纵横曲折的皱襞，输卵管伞端切面呈高度树枝状。我们根据皱襞形态，仅对输卵管壶腹部和峡部进行观测。壶腹部是精子和卵子受精的场所。峡部是精子获能、发生顶体反应和贮存的主要部位。另外，小鼠的排卵是自发排卵(spontaneous ovulation)，排卵时间为动情开始后2～3 h，孕1 d时受精卵已形成并进入输卵管，大约孕4.5～6 d胚胎进入子宫腔并开始着床。

LHR属于G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族中的糖蛋白受体亚家族成员，通过与LH结合而发挥作用，主要分布于性腺组织(睾丸Leydig细胞、卵巢颗粒细胞和黄体细胞)和非性腺组织(子宫、前列腺和乳腺)[5-7]。本实验表明，LHR主要分布于围着床期小鼠输卵管上皮细胞胞浆内，这与Zhang M等报道的LHR在输卵管上皮阴性表达不同[8]。Zhang M等在研究中应用的是C57BL/6雌鼠，取材时也未考虑动情周期，是否与实验材料和动情周期有关，有待证实。我们观察到，LHR在孕1 d和孕4 d组输卵管峡部和壶腹部的上皮细胞着色最强，明显高于动情期和孕6 d组的水平(P﹤0.05)。在动情期，排卵前出现LH峰，而此时输卵管上皮细胞LHR的表达未达峰值，提示LHR的表达不仅由LH本身所诱导，还受雌孕激素、hCG等其他因素的调节[9-11]。在输卵管壶腹部LHR的峰值于孕1 d时出现，而在输卵管峡部于孕4 d时出现，这可能与早期胚胎对输卵管上皮细胞的局部调节有关。

Caspase-3 是半胱氨酸蛋白酶(Caspase) 家族中的一个重要成员，作为细胞凋亡蛋白酶级联反应中一个主要效应因子，参与多种因素诱导的细胞凋亡。Xu JS等的研究发现，人输卵管细胞可维持与其共培养的卵裂期鼠胚线粒体膜电位，抑制Caspase的活性，促进鼠胚发育[1]。Bcl-2可对多种因素诱导的细胞凋亡起抑制作用，使细胞生存期延长。我们的研究表明，Caspase-3和Bcl-2主要存在于围着床期小鼠输卵管上皮细胞的胞浆内，且在输卵管峡部和壶腹部的上皮细胞中具有相同的变化规律，提示它们可能具有相似的调控机制。Caspase-3在动情期的水平最高，在孕早期呈现逐渐下降的趋势，孕4 d降至最低，至孕6 d又有所回升。Bcl-2于孕1 d达到峰值，且在孕1 d和孕4 d的水平明显高于动情期和孕6 d组。提示输卵管上皮细胞Caspase-3和Bcl-2的表达可能是按照配子和胚胎的需要来进行调节的，表现为动情期(排卵前后)输卵管上皮细胞Caspase-3的水平较高，从孕1 d开始，Bcl-2的表达上调，Caspase-3的表达下调，导致输卵管上皮细胞对凋亡的抵抗性增强，以促进输卵管上皮细胞的功能，满足受精和早期胚胎发育的需要；孕6 d时，胚胎已离开输卵管，此时Caspase-3的表达上调，Bcl-2的表达下调，输卵管上皮细胞的功能减弱。

研究结果还显示，LHR和Bcl-2具有相似的变化规律，即均在孕1 d和孕4 d高表达，而Caspase-3在孕1 d和孕4 d低表达。说明LHR、Caspase-3和Bcl-2的表达可能具有一定的相关性。已有研究证实，Bcl-2可通过抑制Caspase的激活底物如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等从线粒体释放到细胞质，而抑制细胞凋亡，这与本研究中Caspase-3和Bcl-2的反向表达同时出现是一致的。Tai P等研究发现，LH不仅可以促进出生后睾丸Leydig细胞的增殖，而且可以通过激活LHR，经ERK1/2 通路抑制Leydig细胞的凋亡[12～13]。由此我们推测，在孕1 d和孕4 d时，活化后的LHR可能以相似的机制导致了输卵管上皮细胞的增殖，同时抑制输卵管上皮细胞的凋亡，以增强输卵管上皮细胞的功能，促进受精和早期胚胎发育。

上述实验结果提示，LHR、Caspase-3和Bcl-2的表达与围着床期小鼠输卵管上皮细胞的功能密切相关，并且LHR、Caspase-3和Bcl-2的表达可能具有一定的相关性，可能是由于LHR的活化导致了输卵管上皮细胞的增殖，同时抑制输卵管上皮细胞凋亡的结果。对于LHR活化的原因，LHR调节输卵管上皮细胞增殖和凋亡的具体机制，以及这些分子与胚胎和其他调节因子的关系等，还有待进一步研究。

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