当归补血汤对感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后细胞凋亡的影响△

郑鸿燕 邰浩清 曾水林

哺乳动物出生后毛细胞不具有再生能力[1]，所以毛细胞的任何损伤都可导致永久性感音神经性听力减退和平衡功能障碍。胚胎干细胞具有自我更新特性和多分化潜能，研究表明采用干细胞移植治疗感音神经性聋能够缓解听力减退，但是内耳干细胞存活数量较少, 不到10%[2], 如何提高植入干细胞的存活率是目前迫切需要解决的问题，移植后其确切的凋亡时相变化特点也需进一步阐明。当归补血汤具有清除氧自由基和抗脂质过氧化作用,它在抗细胞凋亡方面的作用非常值得探讨[3]。本研究采用感音神经性聋大鼠模型，对耳蜗干细胞移植后其干细胞凋亡的时程、细胞形态学特点及当归补血汤的抗凋亡作用进行研究，报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂、仪器 SD大鼠由南京中医药大学动物室提供。Neurobasal培养基、B27 辅助培养基(GIBCO公司)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)；多聚赖氨酸、胰蛋白酶、Nestin抗体、Brdu 以及其单克隆抗体、Myosin ⅦA抗体(Sigma公司)。

主要仪器有离心机、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜。

1.2耳蜗干细胞取材、培养和鉴定方法 麻醉1只孕E14SD大鼠，取出胚胎(共8只)，在超净工作台上分离出耳蜗，分离Corti器，HBSS 液冲洗几次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min，中止反应之后加入0.01 %DNA酶，吸管轻柔吹打成单细胞悬液。以1×105/ml的细胞密度移入培养瓶中培养，每隔3 d半量置换培养基。培养7～9 d后，机械分离细胞球进行传代培养，然后行Nestin和Brdu免疫荧光染色鉴定[4]。

1.3当归补血汤含药血清制作 当归补血汤(金元时代李东垣创造的益气补血汤剂)中只有黄芪和当归两味药，根据“阳生阴长”的理论配伍(黄芪∶当归=5∶1)，临床等效药物浓度为0.5 g/ml。大鼠在第1～3天早晚各给药2 ml/100 g，第4天1次服用全天剂量，采血前禁食12 h，末次给药2 h后采血。取血后分离血清，56℃灭活30 min，-20℃冻存备用。

1.4感音神经性聋大鼠模型建立 选择听力正常健康大鼠125只，体重180～200 g，雌雄兼用，耳廓反射灵敏，无强噪声暴露及耳毒性药物使用史， 活杀时未发现中耳炎。50 mg/kg硫酸庆大霉素腹腔注射，早晚各1 次， 每日检测ABR(EP2566听觉脑干诱发电位仪)1次，以波IV刚出现的刺激强度为阈值，以阈值上升30 dB为停药指标。

1.5耳蜗干细胞移植 感音神经性聋大鼠随机分为耳蜗干细胞移植组(45只)、当归补血汤干预组(45只)及对照组(35只)。分别将耳蜗干细胞悬液、含有当归补血汤的耳蜗干细胞悬液和生理盐水移植入大鼠耳蜗鼓阶。方法：将感音神经性聋大鼠固定在手术台上，水合氯醛深度麻醉，在一侧外耳上部做1.5 cm的手术切口，用钻头钻开直径为1 cm的小洞，发现中耳鼓室后，寻找耳蜗螺旋，用微型钻头在耳蜗鼓阶钻洞。用微量加样器吸入移植液，植入耳蜗鼓阶，每点共注射单细胞悬液9 μl，分三段注射，每段3 μl，注射速度为1 μl /min；注射完毕后，留针5 min；全部注射完毕留针10 min后缝合。

1.6耳蜗取材 三组动物分别在移植后1、3、5、10、15天各随机抽取7只大鼠，戊巴比妥钠深度麻醉后，经左心室插管至主动脉，快速灌注生理盐水150 ml，后用4%多聚甲醛灌注固定，取移植侧耳蜗，后固定24小时用于石蜡切片。另外，耳蜗干细胞移植组、当归补血汤干预组每组分别于上述时间点再各随机抽取2只大鼠，戊巴比妥钠深度麻醉后，取新鲜耳蜗组织标本用于流式细胞仪检测。

1.7免疫荧光染色 Nestin免疫荧光染色鉴定耳蜗干细胞。确定是耳蜗干细胞后进行Brdu(检测具有增殖特性的耳蜗干细胞的细胞核)、Caspase-3(检测凋亡的移植内耳干细胞)和Bcl-2抗体(检测抗细胞凋亡基因蛋白)免疫荧光染色。Nestin多克隆抗体(1:1 000小鼠抗大鼠)、Myosin ⅦA(1:500小鼠抗大鼠)、Caspase-3(1:1 000小鼠抗大鼠)4℃ 24 h, 用0.01 mol/L PBS漂洗三次，Nestin、Myosin ⅦA加山羊抗兔FITC(1：100)(阳性判断标准为绿色荧光)， Brdu、Caspase-3加山羊抗小鼠罗丹明(1：200)(阳性判断标准为红色荧光)， 37℃ 2h，用0.01 mol/L PBS漂洗三次，倒置相差荧光显微镜下观察并摄片，测量细胞累积吸光度(IA)。

1.8流式细胞仪检测 检测移植组和干预组大鼠耳蜗干细胞移植后其干细胞凋亡率，各组分别分析10 000个细胞，采用Annexin V和PI双标方法，在双量变流式细胞仪的散点图上Annexin V+PI-代表早期凋亡细胞，Annexin V-PI+代表坏死细胞。

1.9统计学方法 荧光显微镜下细胞累积吸光度(IA)比较采用Independent - samples-one - way进行检验。对所有数据进行方差分析。

2 结果

2.1孕E14SD大鼠耳蜗干细胞的培养和鉴定 孕E14SD大鼠耳蜗取材的干细胞，培养5～6天后可见大量的悬浮的细胞团形成，呈桑葚状，这些细胞球经Nestin免疫荧光鉴定呈阳性反应，表明是具有自我更新能力的干细胞(图1、2)。传代培养5 d后的典型细胞克隆球几乎呈Brdu/Nestin免疫荧光双标，说明所培养的细胞具有增殖能力，且属于神经前体细胞。在传代培养瓶中偶可见到传代时未被打散的细胞克隆球增殖为巨大克隆球(图3)。

2.2感音神经聋大鼠模型内耳毛细胞检测 排列欠整齐(图4)。

2.3Nestin免疫荧光检测结果 移植后1、3、5、10、15天，耳蜗干细胞移植组和当归补血汤干预组移植部位(鼓阶)有大量Nestin免疫荧光阳性细胞(图5)，正常对照组无免疫荧光阳性细胞。三组移植后不同时间细胞累积吸光度(IA值)比较见表1。

2.4Caspase-3检测结果 移植后1、3、5、10、15天，耳蜗干细胞移植组、当归补血汤干预组大鼠鼓阶有大量Caspase-3免疫荧光阳性细胞，对照组无免疫荧光阳性细胞。三组大鼠细胞累积吸光度(IA值)比较见表2。当归补血汤干预组的凋亡细胞数量较耳蜗干细胞移植组少(图6)，对照组整张片子呈较弱的荧光反应。

2.5BCL-2检测结果 移植后1、3、5、10、15天，耳蜗干细胞移植组、当归补血汤干预组鼓阶部位有大量BCL-2免疫荧光阳性细胞，对照组无免疫荧光阳性细胞。三组细胞累积吸光度(IA值)比较见表3。当归补血汤干预组的BCL-2免疫荧光阳性细胞数量较耳蜗干细胞移植组多(图7)，对照组整张片子呈较弱的荧光反应。

2.6流式细胞仪检测结果 耳蜗干细胞移植组和当归补血汤干预组耳蜗干细胞凋亡率均在移植后3～5天达到峰值，然后进入平台期；当归补血汤干预组在移植后各个时间点的干细胞凋亡率均低于耳蜗干细胞移植组(表4)。

图1体外培养的单个细胞(形成细胞球前)(倒置显微镜×200)

图2体外培养的Nestin免疫荧光阳性细胞球(荧光显微镜×200)

图3体外培养的Brdu/Nestin阳性的细胞(荧光显微镜×200)

图4感音神经性聋模型大鼠耳蜗切片(荧光显微镜×200)图5移植的Nestin+的耳蜗干细胞(荧光显微镜×200)

图6 Caspase-3免疫荧光阳性细胞(荧光显微镜×200)

图7 BCL-2免疫荧光阳性细胞(荧光显微镜×200)

表1 三组大鼠移植后不同时间Nestin阳性细胞IA值(n=7耳)

注：*与当归补血汤干预组比较，P<0.01

表2 三组大鼠移植后不同时间Caspase-3细胞IA值(n=7耳)

注：*与当归补血汤干预组比较，P<0.01

表3 三组大鼠移植后不同时间Bcl-2细胞IA值(n=7耳)

注：*与当归补血汤干预组比较，P<0.01

表4 两组大鼠移植后不同时间耳蜗干细胞凋亡率 (%)

注：*与当归补血汤干预组比较，P<0.05

3 讨论

干细胞具有自我更新能力, 可以在体外大量增殖, 提供充足的细胞来源。目前，神经干细胞已用于脑移植、脊髓移植等来治疗帕金森病、脊髓损伤等病变[5～7]，研究者们也尝试用干细胞移植治疗耳聋。

2003年，Li等从成年小鼠内耳椭圆囊分离培养了出干细胞[8]；Ito等[9]将神经干细胞移植入耳蜗2周后, 发现神经干细胞位于蜗管的内壁, 4周时神经干细胞迁移至Corti器毛细胞的表面并具有内毛细胞或外毛细胞的形态。上述研究表明干细胞可以进入毛细胞缺失的感觉上皮内, 并可以分化为内耳毛细胞。但实验中耳蜗干细胞移植后听功能的改善远远未能达到预期目标，其中一个重要原因在于干细胞移植后存活率很低，其主要原因是发生了细胞坏死和凋亡[10]。所以，如何提高移植的干细胞存活率是目前迫切需要解决的问题。

研究已证实当归补血汤含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等[11～13]。阿魏酸是当归抗氧化作用的有效成分，具有清除氧自由基和抗脂质过氧化作用,对神经生长起着营养维持的作用，以往实验表明当归补血汤能够促进细胞增殖，诱导分化[14]。本课题组前期离体实验研究发现当归补血汤能促进Brdu和Nestin双标阳性的干细胞数量增多，推测与减少细胞凋亡有关[4，15]。本实验结果显示：耳蜗干细胞移植入内耳后1～3天细胞坏死率较高，推测可能与移植时组织内大量缺血缺氧和麻醉有关；而耳蜗干细胞移植入内耳后3～5天，细胞凋亡率远远大于细胞坏死率，此后下降进入平台期，因此可以推断干细胞移植入内耳后3～5天死亡的主要方式为细胞凋亡，提示抗凋亡干预应在移植后的3～5天开始。

本实验采用免疫荧光染色方法发现耳蜗干细胞移植组和当归补血汤干预组大鼠耳蜗切片移植针道周围可见大量的Nestin免疫荧光阳性细胞，说明移植的是内耳干细胞，其中当归补血汤干预组的Nestin阳性细胞IA值高于耳蜗干细胞移植组。而且当归补血汤干预组的Caspase-3阳性细胞IA值低于耳蜗干细胞移植组，说明当归补血汤对移植的内耳干细胞具有保护作用，能够阻断干细胞凋亡的连锁反应，减少移植的内耳干细胞凋亡。因此，应用当归补血汤来增加移植的干细胞的存活率也许能达到预期的效果。Bcl-2 是重要的抗细胞凋亡基因,器官受损时可通过其自身过度表达,抑制Ca2 +释放,阻止促细胞凋亡基因信号传递,发挥抗细胞凋亡作用,从而减轻细胞损伤。本实验结果同时显示当归补血汤干预组的Bcl-2阳性细胞IA值明显高于耳蜗干细胞移植组，由此推断当归补血汤的抗凋亡机制可能通过促进 Bcl-2 蛋白表达增加来抑制细胞凋亡的发生。另外推测当归补血汤还可能通过改善缺血微环境,促进移植组织分泌细胞因子、神经递质或神经营养因子等物质抑制迟发性干细胞凋亡,从而减少移植的内耳干细胞凋亡。其具体机制有待进一步研究。

4 参考文献

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