鸡卡那霉素耳中毒后听神经节Ephrin A2蛋白的表达*

王振涛 向明亮 吴皓李蕴虞文伟 程岚

耳蜗毛细胞及其神经支配的破坏解体是感音性聋的主要发病基础。已发现鸟类耳蜗毛细胞损伤破坏后能够获得完全再生[1～4]，且毛细胞再生后即获得神经再支配，随即有一重塑过程，最终，毛细胞及其神经支配这一复合结构在形态上完全恢复正常，鸟听功能亦恢复正常[1～4]。本研究拟在既往形态学研究[1～3]的基础上，采用免疫组化荧光染色技术观察鸡卡那霉素耳中毒后听神经节ephrinA2蛋白的表达，并探讨其表达与耳蜗毛细胞及其神经支配的再生及重塑有无关系。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 66只新生罗曼鸡(德国进口品种，由上海归兴种鸡厂提供，雌雄兼用)随机分为实验组48只，于生后3 d开始按200 mg·kg-1·d-1连续肌肉注射卡那霉素(sigma.华美生物工程公司上海分公司分装)10 d，再将其设为施药完毕前2 d、施药完毕后1、3、7、10、15、21、30 d 8组，每组6只动物。对照组18只，设3、13、43 d龄3组[1]，每组6只，处死时该三组动物分别与施药开始时、施药完毕后0、30 d时之实验组动物同龄，对照组动物不施与任何药物。所有动物按以上预定时间点行ABR检测后处死，取听神经行免疫组化荧光染色。

1.2ABR检测方法 各组动物处死前先在声电屏蔽室内接受ABR检测，采用Keypoint诱发电位处理系统，前置放大器灵敏度10 μv/d, 带通滤波50～3 000 Hz, 分析时程10 ms,叠加200次。小鸡用10%水合氯醛(240 mg/kg) 经腹腔注射行全身麻醉后，将3枚针形不锈钢电极分别插入小鸡双侧乳突区及双外耳道连线之颅顶正中处皮下，颅顶为记录电极, 测试耳侧为参考电极, 对侧接地线；耳机距外耳道口约0.5 cm。由于卡那霉素耳中毒时，鸟基底乳头的损伤区域约限于近端1/3，该区域的声音感受频率约为3 000 Hz以上，故采用4 000 Hz滤波短声诱发ABR, 刺激率10次/秒。

1.3免疫组化荧光染色及阳性细胞判断标准 将雏鸡用10%水合氯醛腹腔注射全麻后迅速断头处死，暴露耳蜗，消毒镊取出听神经组织，储存于液氮中；将组织标本置入充满OCT的冰模中定向包埋，-23℃；LECA-CM1000型冰冻切片机连续切片，厚20 μm，每3张取1张；用涂有APES防脱胶的切玻片捞起切片，室温下干化；将切片用2%NGS、1%牛血清白蛋白、0.2%Triton X-100孵化以阻滞非特异性抗体配体反应，20分钟；上抗Ephrin A2羊抗鸡多克隆抗体(1：100)(上海宝船生物有限公司)，4℃湿化箱中孵化过夜；PBS清洗后，上驴抗羊IgG-FITC第二抗体(1：200)，室温下孵化2小时；盖片；OLYMPUS BX51荧光显微镜下观察、拍照。阳性细胞判断标准：荧光显微镜下观察，听神经节细胞细胞膜及细胞浆发出强绿色荧光，细胞核无明显荧光可见。

1.4统计学方法 采用SPSS11.0软件统计包非参数统计Mann-Whitney法检验。

2 结果

2.1ABR检测结果 正常对照组雏鸡3、13 d龄ABR反应阈分别为82.9±4.4、71.6±2.6 dB SPL，两组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。43 d龄组ABR反应阈值(70.1±3.3 dB SPL)与13 d龄组基本一致。各组间波Ⅰ潜伏期、振幅无明显差异。实验组3 d龄雏鸡连续施与卡那霉素10 d完毕时，ABR反应阈提高达到最大程度(116.3±4.3 dB SPL)。停药后3 d反应阈(112.0±5.2 dB SPL)与停药后1 d反应阈(116.3±4.6 dB SPL)比较差异有统计学意义(P<0.05)，药毕7d时ABR反应阈(101.5±4.3 dB SPL)较药毕3 d时显著降低(P<0.01)，药毕10 d时ABR反应阈(94.3±4.8 dB SPL)较药毕7 d时进一步降低(P<0.01)，其后反应阈无明显变化。

2.2听神经节组织免疫组化染色结果 正常对照组听神经节组织Ephrin A2阳性染色细胞数较多，呈梯度分布现象(图1)。各时间点ephrin A2阳性染色细胞数无明显差异，由于听神经节组织结构本身较小，故所计数的细胞为全部节细胞，平均每一切面阳性细胞数约160个左右(图2)。

实验组各时间点Ephrin A2阳性染色细胞数变化明显(图3)，用药完毕前2 d、完毕后1、3、7 d组听神经组织ephrin A2阳性染色细胞数较正常对照明显减少(图4)，每一切面阳性细胞数平均不足20个，药毕后15 d时Ephrin A2阳性染色细胞数较前增多，平均每一切面阳性细胞数约70个左右，至药毕后30 d时(图5)ephrin A2阳性染色细胞数已接近正常对照，平均每一切面阳性细胞数约130个左右。

图1正常对照组动物生后13d时听神经组织冰冻切片ephrinA2免疫组化荧光(FITC标记)染色阳性染色细胞数多，有呈梯度分布现象。黑色箭头示阳性细胞，空白箭头示阳性细胞稀少处(×200)

图4实验组动物药毕后1 d时听神经组织冰冻切片Ephrin A2免疫组化荧光(FITC标记)染色阳性染色细胞极少(黑色箭头所示)，空白箭头示无阳性细胞处(×200)

图5实验组动物药毕后30 d时听神经组织冰冻切片Ephrin A2免疫组化荧光(FITC标记)染色阳性染色细胞(黑色箭头所示)数明显增多,基本接近正常(×200)

图2正常对照组各时间点听神经节组织Ephrin A2免疫组化荧光染色阳性细胞数

图3实验组动物听神经节组织Ephrin A2免疫组化荧光染色阳性细胞数

3 讨论

对卡那霉素中毒后鸡耳蜗的扫描及透射电镜观察到[1～3]，连续施药8 d(即施药完毕前2 d)时, 鸡耳蜗近端毛细胞及其神经支配损伤明显,施药10 d完毕时,耳蜗近端损伤区域毛细胞及其神经支配已完全破坏消失；施药10 d完毕后1 d时，损伤区域可见少数幼稚再生毛细胞，并已获传入和传出神经再支配，与正常对照组相比，其时再生毛细胞的神经再支配模式极为幼稚，其后，随着毛细胞的发育，其神经支配形态变化亦趋成熟；药毕15 d时，再生毛细胞的神经支配已接近正常对照组；药毕60 d时，再生毛细胞的神经支配已与正常对照基本相同。

从文中结果看，连续施药8 d(药毕前2 d组)，也就是当鸡耳蜗近端毛细胞及其神经支配损伤明显时，听神经节组织中ephrinA2的蛋白表达明显降低；施药10 d完毕时，即当原始毛细胞及其神经支配破坏最为明显、耳蜗毛细胞神经连接开始再生时，ephrinA2的蛋白表达降低达到最大程度。 Lee[5]等亦曾观察到，鸡庆大霉素中毒后，其耳蜗ephrinA2的蛋白表达明显降低，与文中结果相似。此外，还观察到，药毕15 d， 即当再生毛细胞神经再支配的重塑大部分完成时，ephrinA2的阳性染色细胞数较前明显增多；药毕30 d，当再生毛细胞神经神经再支配的重塑进一步完成时，ephrinA2的阳性染色细胞数已基本接近正常，与相关形态学研究[1～3]比较，说明鸡卡那霉素耳中毒后其耳蜗听神经节中ephrinA2蛋白的表达变化与耳蜗毛细胞及其神经支配的再生及重塑过程基本相同步。

此前的相关形态学研究观察到，当耳蜗原始毛细胞被卡那霉素损伤破坏时，支配它的神经末梢亦从其正常所在位置消失[1]。由于神经末梢在组织结构上主要为轴膜和流动的轴浆，要达到多个研究对象观察目标的一致性难度极高，而支配再生毛细胞的神经末稍来源于听神经节，故通过观察听神经节组织中某些因子的变化来探讨其与相关形态变化的关系就显得较为实际。相关文献报道显示，ephrinA2作为酪氨酸激酶受体最大亚族Eph的配体ephrin的重要成员，其与受体结合后所产生的重要作用即与轴索生长锥的生长、局部空间定位、以及突触的形成及重塑有关[6]，同时，ephrinA2的表达不仅与神经组织的形态发生发育有关，还与神经组织的损伤修复亦有关[7]；将成年大鼠视神经切断后，残存的视网膜神经节细胞中ephrinA2的表达明显上调[7]，因此，认为鸡卡那霉素耳中毒后其耳蜗听神经节中ephrinA2蛋白的表达变化与耳蜗毛细胞及其神经支配的再生及重塑过程基本相同步可能并非一偶然现象，提示其在鸡卡那霉素中毒后耳蜗毛细胞神经连接的再生及重塑过程中有着重要作用。此有待于进一步的深入研究去证实。

4 参考文献

1 Xiang ML, Mu MY, Pao X,et al. The reinnervation of regenerated hair cells in the basilar papilla after kanamycine ototoxicity[J]. Acta Otolaryngol (Stockh), 2000,120:912.

2 Xiang ML,Wu H, Huang H, et al. Effects of prolonged kanamycin administration on cochlear anatomy and auditory brainstem response thresholds in chickens.[J] Arch Otolaryng & Head Neck Surg, 2008，134：503.

3 向明亮，吴皓，黄琦,等.鸡卡那霉素耳中毒后听功能恢复不全的形态基础[J].听力学及言语疾病杂志，2003, 11：193.

4 Duckert LG,Rubel EW. Morphological correlates of functional recovery in the chicken inner ear after gentamycin treatment[J]. J Comp Neurol,1993,331:75.

5 Lee KH, Warchol ME. Ephrin A2 may play a role in axon guidance during hair cell regeneration[J]. Laryngoscope, 2005,115:1 021.

6 Martinez A, Soriano E. Functions of ephrin/Eph interactions in the development of the nervous system: emphasis on the hippocampal system[J]. Brain Res Brain Res Rev,2005,49:211.

7 Svmonds AC, King CE, Bartlett CA, et al. EphA5 and ephrin-A2 expression during optic nerve regeneration: A "two-edged sword"[J]. Eur J Neurosci, 2007,25:744.