CX26不同结构域错义突变体的表达和定位*

杨中纯 肖自安 谢鼎华

耳聋是引起交流障碍最常见的疾病，新生儿中先天性重度以上耳聋的发病率高达1/1 000，其中一半是遗传因素所致[1]。GJB2 (gap junction protein β-2)基因缺陷是非综合征型常染色体显性遗传性聋DFNA3和隐性遗传性聋DFNB1以及合并感音神经性聋的掌趾角化征的遗传基础，是最常见的耳聋基因[2]。GJB2基因编码蛋白CX26为膜蛋白，4次跨越胞膜，有9个结构域(区段)，包括3个胞内段(N端IC1、胞内环IC2、C端IC3)、4个跨细胞膜段(TM1、TM2、TM3、TM4)、2个胞外环(EC1、EC2)[3]，跨膜区和胞外环是高度保守的，而IC2和IC3段差异较大，IC1与TM1的细胞内侧段构成电压感受器的电荷复合体， EC1、EC2决定CX26与其他CX蛋白的相容性，IC2和IC3与间隙连接通道PH门控有关[4]。已发现的与耳聋相关的100余种GJB2突变覆盖CX26的9个结构域。本研究从CX26的9个结构域中各选择1个致聋错义突变(表1和图1)，观察突变体蛋白在HeLa细胞的表达及定位，为进一步研究CX26致聋突变体组装、运输和定位及间隙连接通信功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验材料 pEGFP-N1载体、HeLa细胞和大肠杆菌Top10菌种由中南大学医学遗传学国家重点实验室提供。HeLa细胞是一种很容易离体培养的细胞，该细胞没有内源性的间隙连接表达，因此被广泛应用于间隙连接蛋白功能分析的体外实验[5]。Pyrobest 酶、dNTP 和限制性内切酶EcoR、SalⅠ及 T4DNA 连接酶购自TaKaRa 公司(中国大连)；引物由上海博亚生物工程公司合成，普通琼脂糖购自BIORAD公司(德国)，Perkinelmer 9600PCR 仪(ABI公司，美国)，BIORAD凝胶电泳仪(BIORAD公司，德国)，Eppendorf 台式冷冻离心机(Eppendorf公司，美国)。

1.2引物设计 见表1。

表1 CX26的9个突变体构建的引物

注：下划线碱基为酶切位点序列。p.S19T和P.L214P为长引物法构建，只有1个引物，其余有双向引物。p.CX26为野生型

图1 CX26蛋白4次跨细胞膜的结构拓扑图及本研究中的9个结构域上各1个错义突变

1.3CX26突变体的构建 利用上述引物，overlap PCR法或长引物快速法构建各个突变，用 EcoR I / Sal I 双酶切野生型p.CX26 质粒及各突变质粒及pEGF-N1 载体后，回收纯化双酶切的野生型p.CX26 质粒及各突变质粒pEGF-N1 载体，16℃连接过夜，转化大肠杆菌 Top10，挑选重组克隆，用 EcoRI/ Sal I双酶切经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取初步筛选的阳性质粒送上海生工技术有限公司测序，测序鉴定后QIAGEN-tip 100提取质粒，转染HeLa细胞。

1.4CX26突变蛋白的Western blot分析 取培养细胞，弃培养基。加2XSDS sample buffer裂解细胞，超声后，用蛋白定量试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度。各取20μg总蛋白经12% SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶粉封闭1小时后，加入GFP单抗，4 ℃过夜，TBST洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的鼠二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜后，ECL发光，曝光。

1.5CX26突变体在HeLa细胞的定位观察 取培养细胞，弃培养基。3.7%多聚甲醛 / PBS室温固定15 min，PBS洗2次，每次5 min；0.2% TritonX-100 / PBS透化10 min，PBS洗2次，；5%BSA室温封闭30 min；1∶200稀释的GFP单抗室温孵育60 min，PBS洗7次，每次5 min；5%BSA室温封闭20 min；1∶400稀释鼠cy3二抗40 μl，避光室温孵育60 min；1×PBS洗5次，每次5 min。DAPI染细胞核，室温，避光反应2 min；PBS洗2次，每次5 min；去离子水洗一次，封片，荧光显微镜观察，激光共聚焦显微镜扫描和照相。

2 结果

2.1突变体的构建 突变体与EGFP重组质粒用EcoR I/ Sal I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，在近 750 bp和4 000 bp 处各有一条带，分别对应于突变蛋白和EGFP蛋白，说明突变片段已经连接到克隆载体上(图2)，DNA测序结果证实CX26突变体和野生型的重组载体序列未发生其它碱基序列改变。

2.2突变体在 HeLa细胞的表达和定位 突变融合蛋白质粒转染HeLa 细胞后，免疫印迹结果显示CX26各突变体和野生型在HeLa细胞均表达(图3)。 其中p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R165W突变体和野生型蛋白能转运至细胞膜并形成间隙连接斑，而p.R32H、p.R143W、p.S199F、p.L214P突变体在细胞质中呈弥漫分布，不能转运至细胞膜，无间隙连接斑形成(图4)。

图2 CX26突变体重组质粒EcoR I/ Sal I双酶切后琼脂糖凝胶电泳图a和b图示p.S19T、p.V84L、p.V95M、p.E47K、p.R32H、p.L214P、p.GFP-N1、p.wtCX26、p.S199F、p.R165W和p.R143W突变体与pEGF的重组质粒经EcoR I/ Sal I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳在近 750 bp和4 000 bp 处各有一条带，分别为插入的CX26和pEGF

图3 CX26各突变体和野生型CX26与pEGF的重组体在HeLa细胞中表达产物的Western blot检测结果对应于接近49KD的条带是融合蛋白，对应于接近25KD的条带是pEGF蛋白

3 讨论

GJB2基因编码的CX26在耳蜗表达于非感觉上皮细胞和结缔组织细胞，是感觉毛细胞兴奋后K+回循环的路径[6]。GJB2基因突变后，突变的CX26不能形成间隙连接或不能形成有功能的间隙连接，K+回循环障碍，从而导致感音神经性聋[7～9]。研究报道，CX26不同的错义突变蛋白在细胞内的表达定位和功能改变不尽相同，如位于TM2结构域的p.W77R突变蛋白只仅在细胞浆表达，不能被转运到细胞膜[10]；位于ICL结构域的p.R127H在细胞膜表达，但组成的间隙连接功能受损[8]。

为了观察CX26不同结构域上的错义突变蛋白的表达、亚细胞定位和功能的改变，本文从CX26的9个结构域上各选择1个错义突变，构建成与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的载体，转染HeLa细胞，Western blot分析突变这些蛋白均在细胞中能翻译和表达，通过观察EGFP在细胞中的定位可确定CX26突变体在亚细胞器中的表达定位。结果发现，位于IC1的p.S19T、EC1段的p.E47K、TM2段的p.V84L、IC2段的p.V95M、EC2段的p.R165W突变体和CX26野生型蛋白一样在细胞膜表达并形成间隙连接斑，说明这5个突变体在HeLa细胞的核糖体合成后能够聚合成半通道并被转运到细胞膜，形成间隙连接斑。其导致耳聋的原因可能是所形成的间隙连接的通讯功能消失或下降，有待于对形成的间隙连接进行功能分析来验证。Beltramello研究发现p.V84L突变蛋白对第二信使分子IP3通透性较野生型低[11]，Stong发现p.E47K组成的间隙连接无功能[12]，支持本文的推测。本研究还发现位于TM1的p.R32H、TM3的p.R143W、TM4的p.S199F、IC3的p.L214P突变体在细胞质中呈弥漫分布，在细胞膜无表达、无间隙连接斑形成，说明这4个突变体在核糖体合成后不能够被转运到细胞膜，因此细胞膜上无间隙连接斑形成，细胞间隙连接通讯功能缺失，导致耳聋。本研究还发现胞内IC1段p.S19T、p.IC2段p.V95M形成间隙连接，而IC3段p.L214P不能形成；细胞膜内的TM2段p.V84L形成间隙连接，而TM1段p.R32H、TM3段p.R143W、TM4段p.S199F不能形成；胞外的EC2段p.R165W形成间隙连接，EC1段p.E47K不能形成；提示错义突变位点所处的CX26结构域与突变蛋白功能改变无关。Stong报道EC1段的p.G45E在转染细胞24h后导致细胞死亡，与同一结构域中的p.E47K突变体出现的改变不同[12]，Martínez总结了文献报道的CX26不同结构域的29个错义突变体在体外细胞表达、定位和间隙连接功能[13]，也发现错义突变功能改变与所处的结构域无关，支持本文结论。

图4 CX26野生型和突变体在HeLa细胞中表达后的共聚焦显微镜扫描图(×400) a：WT(野生型CX26)、p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突变体定位于细胞膜，并能形成间隙连接斑(黄色箭头)。b：p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P突变体在细胞质中呈弥漫分布，细胞膜上无间隙连接蛋白表达及间隙连接斑形成

在本文所选择的CX26的9个突变体中，已有文献报道对其中的p.S19T[14]、p.E47K[12]、p.V84L[11]、p.V95M[15]、p.R143W[16,17]和p.L214P[17]共6个突变体进行了类似研究，除p.R143W外，其余结果均与本研究基本一致。Wang等报道，p.R143W转染N2A细胞后能在细胞膜上形成对荧示光踪剂具有通透性的间隙连接[16]；Mese将p.R143W在蟾蜍卵细胞表达，发现不能形成间隙连接[17]。Wang的发现与本研究在HeLa细胞中的结果完全相反，而Mese的结果与本研究的发现相似。这可能与CX26在核糖体翻译后要经过修饰并聚合成六聚体后才能转运到细胞膜这一过程有关，不同的细胞中修饰和转运的因素存在差异，形成间隙连接能力不一样。

本文仅观察了CX26突变体在HeLa细胞的表达和定位。在下一步研究中，将通过染料转移实验及膜片钳实验分析p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突变蛋白所形成的间隙连接的通讯功能，并通过内质网及高尔基体染色来观察p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P突变蛋白在细胞转运过程具体受阻的亚细胞部位，进一步探讨CX26致聋突变体组装、运输和定位及间隙连接通信功能的影响机理。

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