结直肠癌组织中抑癌基因PTEN的表达及其与临床病理特征的关系

徐臣光 (浙江省泰顺县人民医院 325500)

PTEN(第10号染色体丢失的与张力蛋白同源的磷酸酶基因)是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，在维持细胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用，因其独特的作用途径和在多种人类肿瘤的发病机制中的重要作用而备受重视[1]。研究表明，PTEN是继p53基因之后发现的人类肿瘤中最易发生突变的抑癌基因[2]。人类许多肿瘤中存在着PTEN功能的失活。本研究通过免疫组化法检测PTEN蛋白在大肠癌组织中的表达，并探讨其与患者的临床病理特征的关系。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 标本来源 60例标本均选自我院病理科存档蜡块，为2005年1月至2008年2月间收集的原发性结直肠癌手术切除标本。所有标本均经4%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，石蜡包埋，切片厚4μm。男37例，女23例；年龄37～75岁，平均54.2岁。所有标本的患者术前均未接受化疗及放疗，另外取36例癌旁正常组织(距肿瘤边缘5cm以上)作对照。

1.2 主要试剂和仪器 鼠抗人PTEN单克隆抗体(一抗，即用型)和免疫组化Envision试剂盒，福州迈新生物技术开发公司；YWY 781医用微波仪，浙江临安电子器材厂；LEICA显微镜DMLB，德国徕卡公司；电热恒温培养箱，嘉兴新塍东城仪器厂；组织陈列仪为朝阳恒泰科技发展公司的产品(HT-1型)。

1.3 免疫组化染色 采用Envision二步法。切片常规脱蜡，3%过氧化氢溶液室温孵育20min，水洗，0.05%胰酶37℃消化15min，PBS液冲洗，正常血清阻断10min，分别滴加一抗工作液，PBS液冲洗，滴加二抗工作液37℃孵育30min，PBS液冲洗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明和封片。以正常扁桃体组织做阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 免疫组化结果以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。细胞未着色及阳性细胞<5%为阴性(－)；5%～25%的细胞显色为弱阳性(＋)；25%～50%的细胞显色为中等阳性(＋＋)；>50%的细胞显色为强阳性(＋＋＋)。

2 结果

2.1 PTEN在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达 PTEN主要在结直肠癌胞浆表达，部分病例也可见到胞浆和胞膜同时着色，且染色较强。60例结直肠癌标本中PTEN的阳性表达为18例(30.0%)，其中强阳性为6例(10.0%)，部分标本表达降低或缺失。36例癌旁正常组织中PTEN蛋白表达均为阳性，其中强阳性31例(86.1%)。

2.2 结直肠癌中PTEN的表达与临床病理特征的关系结直肠癌高、中、低分化PTEN表达阳性情况依次为12例(50.0%,12/24)、5例(25.0%，5/20)和1例(1/16)，低分化、中分化结直肠癌阳性率较高分化明显降低(χ2=9.107,P<0.01)，且PTEN表达水平随原发病灶的浸润深度、淋巴结转移和远处转移呈逐渐下降趋势。见表1。

表1 结直肠癌组织中PTEN的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

大肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段、有序的过程，主要是由于癌基因功能增强、抑癌基因及DNA修复基因突变或功能缺失所致。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活导致的细胞异常增殖是该过程中的重要分子机制之一[3]。

PTEN是近年发现的一个新的抑癌基因。PTEN基因定位于染色体10q23.3，全长218 kb，有9个外显子和8个内含子，长1212 bp，mRNA长5.5 kb，其cDNA含有一个1209 bp的开放阅读框架，编码由403个氨基酸残基组成。PTEN中与抑癌功能相关的结构域主要是氨基端的磷酸酶结构域、脂质结合C2结构域和羧基端结构域。PTEN蛋白的氨基端与张力蛋白和辅助蛋白高度同源，与肌动蛋白在锚着点处结合，与该位点的复合物共同参与细胞生长调节，故PTEN可能通过下调该位点复合物中的整合素来抑制肿瘤。此外，PTEN还可通过参与细胞的聚集黏附而抑制肿瘤细胞的浸润及转移。目前已经证实PTEN与多种肿瘤的发生发展有密切的关系。在许多肿瘤中都有FIEN基因表达异常，且其表达异常与肿瘤发生发展的生物学行为有一定相关性。

柯细松等[4]应用PCR-LIS-SSCP 法对大肠癌及正常大肠石蜡包埋组织中PTEN的第7、8个外显子进行点突变检测，结果10例正常大肠组织未见阳性带，60例大肠癌标本中，第7外显子SCPP带型阳性检出率为46.7%，第8外显子未见阳性带。唐卫中等[5]应用免疫组织化学方法对23例大肠正常黏膜组织、28例大肠腺瘤和75例大肠癌中PTEN蛋白表达进行检测，研究发现正常大肠黏膜与大肠腺瘤之间无明显差异，而75例大肠癌中有24例蛋白丢失，43例蛋白表达低下，只有8例蛋白表达正常，总阳性率达68%(51/75)，与正常大肠黏膜及大肠腺瘤差异有统计学意义。但Taniyama等[6]用RT-PCR和免疫组化方法在mRNA水平上检测正常结肠黏膜组织、结肠腺瘤组织和癌组织检测PTEN的表达，发现在结肠组织中均无PTEN丢失。本研究结果发现，结直肠癌患者标本中PTEN蛋白的表达降低或缺失，且PTEN表达水平随原发病灶的浸润深度、淋巴结转移和远处转移呈逐渐下降趋势，这与Jiang等[7]的研究结果是一致的。表明随着肿瘤的浸润及转移，PTEN 蛋白表达下降。PTEN 能下调PIP3/ AKt途径，诱导缺氧诱导因子(HIF21)合成而致血管内皮生长因子(VEGF)合成增加。体内外试验表明，野生型PTEN过表达通过PIP3激酶信号传导，增加VEGF介导的各种细胞反应，增强细胞分裂、迁移等[8]。同时，PTEN表达缺失或降低能使金属基质蛋白酶(MMPs)易于表达。Maehama等[9]研究发现，PTEN 能使FAK去磷酸化，从而干扰细胞间的黏附性。而肿瘤细胞中PTEN丢失或表达下降，使MMPs及VEGF合成增加，导致肿瘤细胞向基质浸润和血管形成，形成肿瘤组织细胞的浸润转移，本研究结果支持以上观点。

大肠癌的发生和发展是一个有多种基因参与、相互作用的复杂过程。PTEN参与结直肠癌的发生发展过程，PTEN基因与结直肠癌临床病理特征具有明显相关性。PTEN基因有望成为结直肠癌基因治疗的新靶点。

[1]周隽，吴强，杨枫.乳腺癌中PTEN表达及其临床病理意义[J].临床与实验病理学杂志, 2003,19(2):162-164.

[2]Cantley LC, Neel BG. New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phoshoinositide 3-kinase/AKt pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96 (8): 4240-4245.

[3]Zheng LZ，Wang LW，Ajani J，et a1．Molecular basis of gastric cancer development and progression[J]. Gastric Cancer，2004,7(2):61-77．

[4]柯细松，曾昭淳，刘万里.PCR-LIS-SSCP检测大肠癌PTEN基因的点突变[J]. 实用癌症杂志, 2002,17(1):28-30.

[5] 唐卫中，高枫，唐宗江，等.大肠良恶性肿瘤PTEN/MMAC1/ TEP1肿瘤抑制基因的蛋白表达研究[J].大肠肛门病外科杂志, 2001,7(2) :9-13.

[6]Taniyama K，Goodison S，Ito R，et al. PTEN expression is maintained in sporadic colorectal tumors[J]. J Pathol, 2001,194 (3) :341-348.

[7]Jiang YA, Fan LF, Jiang CQ, et al. Expression and significance of PTEN, hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2003,9(3): 491.

[8]Huang J, Kontos CD. PTEN modulates vascular endothelial growth factor-mediated singnaling and angiogenic effects [J]. J Biol Chem,2002,227 (13):10760-10766.

[9]Maehama T, Taylor GS, Dixon JE. PTEN and myotubularin: novel phosphoinositide phosphatases[J]. Ann Rev Biochem, 2001,70:247-279.