壳寡糖接枝葡萄糖产物的抗氧化性研究

林家超,王 巍,汪连生,覃彩芹

(孝感学院生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室,湖北孝感432000)

壳寡糖接枝葡萄糖产物的抗氧化性研究

林家超,王 巍,汪连生,覃彩芹

(孝感学院生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室,湖北孝感432000)

壳寡糖与葡萄糖反应,在p H 2.9～11.0内,碱性增加,反应加快;在40～95℃内,温度升高,反应加快。所得接枝产物溶于水,比壳寡糖有更强的抗氧化能力。

壳寡糖;葡萄糖;接枝;抗氧化作用

甲壳素是自然界仅次于纤维素的第二大天然高分子多糖,广泛存在于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物及真菌和藻类的细胞壁中。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物,市售产品主要来源于虾蟹壳[1]。壳聚糖可溶于某些酸溶液中,但不溶于中性介质,影响其在体内的消化与吸收,使它的一些生理活性发挥受到限制。壳寡糖是壳聚糖经酶降解后得到的低分子量产物[2],具有水溶性好、易被动物体吸收的特点,有更好的增强免疫能力、调节体内酸碱平衡、抗氧化的功效[3-4]。但是,由于壳寡糖本身分子中含有氨基和还原半缩醛基,易于相互反应,致使壳寡糖在气温较高的空气中易变成棕黑色[5],失去水溶性和生理活性。因而,本文采用葡萄糖与壳寡糖反应,制备壳寡糖接枝葡萄糖产物,并研究它们的抗氧化活性。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

壳聚糖,分子量52.5万,脱乙酰度90.5%,浙江金壳生物化学有限公司产品;α-淀粉酶,北京奥博星生物技术责任有限公司产品;其他试剂为分析纯。

1.2 样品的测定

以凝胶渗透色谱(GPC)测定壳寡糖分子量:TSKG-5000和 TSKG-3000联柱,RI-101示差检测器,在 TSP P1000高效液相色谱仪上测定。标准样品为已知分子量的 TOSOH Pulluan,流动相为0.2mol/L CH3COOH/0.1mol/L CH3COONa溶液,流速为1.0 mL/min,数据由JS-3050江申色谱工作站处理。

红外光谱 IR:Nicolet Impact 380红外光谱仪,KBr压片。

1.3 壳寡糖的制备

20g壳聚糖溶解在500mL的1%(w/w)醋酸溶液,搅拌0.5h后,调节温度为48℃,加入0.4g α-淀粉酶,持续搅拌6h,然后把溶液放入沸水中煮10 min,离心,弃去不溶物,然后滤液减压浓缩至约150mL,调p H值为9,用无水乙醇沉淀,离心,乙醇洗涤,用五氧化二磷干燥备用。

1.4 不同条件对反应的影响

时间对反应的影响:0.2 g壳寡糖在20 mL水中溶解完全后,加入0.2 g葡萄糖,p H为6.5,于 75 ℃反应 ,在 0、1、2、3、4、5 h 分别取样用分光光度计测定溶液在340nm处的吸光度值。

p H值对反应的影响:0.5 g壳寡糖在35m L水中溶解完全后,加入0.5 g葡萄糖,分别取4m L溶液加入8支刻度试管中,用 HCl或NaOH调节pH值,每支试管定容为5mL,于57℃反应1h,用分光光度计测定溶液在340nm处的吸光度值。

温度对反应的影响:0.3 g壳寡糖在20mL水中溶解完全后,加入0.3 g葡萄糖,p H为6.5,分成6份,于不同温度下反应1h,用分光光度计测定溶液在340 nm处的吸光度值。

1.5 接枝产物的制备

分别称取 2份3.0 g壳寡糖,各自溶解于30m L水中,分别加入1.5g和3.0g葡萄糖,调节p H值为9,60℃搅拌5h后,减压浓缩,用无水乙醇沉淀,洗涤,用五氧化二磷干燥,得到接枝产物COS-G1和COS-G2。

1.6 抗氧化性

用缓冲溶液配制浓度分别为3×10-2、18×10-5、225×10-5mol/L的蛋氨酸、核黄素、氯化硝基四氮唑兰溶液,依次各取以上溶液0.5m L于反应管中,并向反应管中分别加入0.5mL壳寡糖和接枝产物水溶液(浓度为0.5,1.0,2.0,4.0 mg/mL),再加1m L蒸馏水,混合均匀后,将反应管在恒定光强日光灯下照射30min,用分光光度计在560nm处测定各样品的吸光度,各样品重复测定3次。清除率的计算式可表示为:清除率 =[(A0-A)/A0]×100%。

2 结果与讨论

2.1 壳寡糖的分子量

图1所示为壳聚糖原料和降解后的壳寡糖产物的 GPC图。与壳聚糖原料峰相比,壳寡糖峰向着洗脱体积增大的方向移动。所测壳寡糖样品平均分子量为1582。

图1 壳聚糖原料CS和壳寡糖COS的 GPC

2.2 反应条件的影响

随着反应时间的延长,溶液颜色加深,吸光度值增加。从表1可以看出,吸光度1h内增加较大,1h至5h吸光度值增加缓慢。说明在1h内反应已基本完成,壳寡糖中的氨基与葡萄糖中的醛基容易反应。

表1 不同时间的反应液的吸光度值

从表2可以看出,吸光度值随着p H值的增加而增加,说明反应在碱性条件下进行时,有利于氨基进攻醛基。

表2 不同p H值的反应液的吸光度值

从表3可以看出,随着反应温度的升高,反应液的吸光度值增大,说明随着温度的升高,反应速度加快。

表3 不同温度下的反应液的吸光度值

2.3 接枝产物的红外光谱图

图2为壳寡糖和接枝产物的红外光谱图。壳寡糖在1634和1561 cm-1处的峰分别为壳寡糖中酰胺I和酰胺 II的谱带。参照酰胺 II谱带,接枝产物在1640 cm-1处的峰明显增强,为酰胺 I谱带和新生成C=N对称伸缩振动峰的叠加峰[6]。

2.4 美拉德反应的产物对超氧阴离子自由基的清除

图2 壳寡糖COS和接枝产物COS-G2的红外光谱

用光照核黄素的方法产生O2-·,可以使氯化硝基四氮唑兰产生蓝色物质,该物质在560 nm处有最大吸收峰。随着反应的进行,蓝色物质的生成就越多,加入壳寡糖可使O2-·的量降低,进而蓝色物质的生成减少,因此,测定该波长下的吸光度值的变化,可反映壳寡糖和接枝产物对O2-·的清除能力。

图3 壳寡糖与葡萄糖接枝产物对光照核黄素产生超氧阴离子自由基的清除作用

由图3可见,壳寡糖和接枝产物清除超氧阴离子的能力随浓度的增加而增强,同一浓度时,COS-G2的清除率大于COS-G1,两者都大于COS,说明壳寡糖与葡萄糖接枝后的产物具有更好的抗氧化性。

[1] Kumar M N V R,M uzzarelli R A A,Muzzarelli C,et al.Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J].Chemical Review s,2004,104:6017-6084.

[2] Kim S K,Rajapakse N.Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides(COS):A review[J].Carbohydrate Polymers,2005,62:357-368.

[3] Yen M T,Yang J H,Mau J L.Antioxidant properties of chitosan from crab shells[J].Carbohydrate Polymers,2008,74:840-844.

[4] Tomida H,Fujii T,Furutani N,et al.Antioxidant properties of some different molecular weight chitosans[J].Carbohydrate Research,2009,344:1690-1696.

[5] Zeng L T,Qin C Q,ChiW L,et al.Brow ning of chitooligomers and their optimump reservation[J].Carbohydrate Polymers,2007,67:551-558.

[6] 应国清,卢霞,易喻.壳聚糖吸附剂的制备及性能[J].化工进展,2007,26(2):230-233.

Preparation and An tioxidation of Glucose-grafted Chitooligomers

Lin Jiachao,Wang Wei,Wang Liansheng,Qin Caiqin
(H ubei Key Laboratory of Biomass-Resource Chem istry and Environmental Biotechnology,Xiaogan University,Xiaogan,Hubei 432000,China)

Chitooligomers reacted with glucose.The reaction rate increased with the increased pH in the range of p H 2.9～11.0.The reaction rate increased with the increased temperature in the range of 40～95℃.The obtained products were soluble in water,and had stronger antioxidation than the chitooligomers.

chitooligomers;glucose;graft;antioxidation

O636.11

A

1671-2544(2010)03-0005-03

2010-03-30

湖北省教育厅科学研究重大项目(Z200626001)

林家超(1985— ),男,湖北武汉人,孝感学院化学与材料科学学院2008届本科毕业生。

覃彩芹(1965— ),男,湖北赤壁人,孝感学院化学与材料科学学院教授,博士。

(责任编辑:邹礼平)