应用生物反应器建立人用冻干狂犬病疫苗(Vero细胞)生产工艺的研究

李志强,袁延宝,郑淑媛,代长海,张夫坤,顾丹阳,戚凤春

(长春生物制品研究所,吉林长春 130062)

狂犬病是一种人兽共患疾病,由于狂犬病在发病以后无药可治,因此死亡率达到100%,对于被狂犬咬伤的人群,最有效的方法是接种狂犬疫苗,我国每年大约有1 000万～1 200万人接受狂犬病毒暴露后的疫苗接种[1]。由于近年来国内狂犬病的发生率有所升高,因此国家药监部门对狂犬疫苗的质量要求越来越高。人用狂犬病疫苗的生产,病毒收获液的毒力滴度是影响疫苗效价的一个关键因素,由于采用转瓶进行细胞培养所收获的病毒原液毒力较低,经纯化后很难生产出合格的狂犬病疫苗,而通过生物反应器对细胞进行高密度的培养,可以制备出高毒力的病毒收获液,从而提高狂犬病疫苗的效价。本试验以生物反应器加入片状载体对细胞进行高密度培养,制备出高毒力滴度的病毒收获液,经纯化后生产出合格的冻干人用狂犬病疫苗,疫苗经检定后各项指标均符合规程要求。此工艺适于工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与毒种 ①Vero细胞,由本所疫苗一室提供;②aG株;由本课题组从狂犬病毒豚鼠脑毒种经Vero细胞适应后获得。毒种毒力为8.0 lgLD50/mL。

1.1.2 仪器设备 ①生物反应器:New Brunswick Scientifc.CO. INC,USA生产,容积15 L,工作容积11.25 L,以压缩空气、O2、N2、CO2调控DO和pH。使用前DO及pH传感器标化准确[2-4];②超滤器:Milliber公司生产,膜包分子量为10万;③层析柱:采用Sepharose4FF柱色谱法纯化,Sepharose4FF由GE Healthcare生产[5];④冻干机:国产小型冻干机。

1.1.3 试剂与载体 ①细胞培养液:199/EBSS美国海克隆实验室公司生产,补加10%(细胞生长期)、1%(细胞维持期)的小牛血清;②小牛血清:400 mL/瓶、武汉三利生物技术有限公司生产;③片状载体:由Jiffy Packaging Company生产,加入量为50 g/L。

1.2 方法[6-7]

1.2.1 培养条件 ①批次培养:细胞培养罐接种细胞后,经37℃培养3 d,再接种狂犬病毒,经33℃培养3 d,开始收获病毒收获液,每24 h收获一个细胞培养罐工作体积的病毒收获液。收液时全部吸出,然后加入新的培养液继续培养;②连续灌流培养:细胞培养罐接种细胞后经37℃培养3 d,再接种狂犬病毒,经33℃培养3 d,开始收获病毒收获液,用蠕动泵收取病毒收获液的同时加入新的培养液,每24 h收获一个细胞培养罐工作体积的病毒收获液。

1.2.2 病毒收获液毒力测定 用Reed-Muench计算LD50。

1.2.3 病毒收获液超滤纯化 检定合格的病毒收获液经超滤浓缩60倍、80倍,经β-丙内酯灭活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙内酯经37℃水解2 h),灭活合格的浓缩液通过层析柱进行纯化。

1.2.4 疫苗的配制和冻干 纯化后的病毒液,加入适量的人血白蛋白作为保护剂,即为原液,取原液按20%的比例加入赋型剂进行分装冻干,制备出冻干狂犬病疫苗。

1.2.5 疫苗效价测定 用N IH法测定效价。

2 结果与分析

2.1 培养方式对病毒收获液毒力滴度的影响

图1 2008-2批次培养病毒收获液毒力曲线Fig.1 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-2)after batch culture

图2 2008-3连续灌流病毒收获液毒力曲线Fig.2 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-3)after continuous flow culture

从图1、图2看出,批次培养与连续灌流培养2种培养方法在收获的病毒收获液的毒力滴度上没有明显区别,收获前3次病毒收获液的毒力逐渐上升,4～7 d达到最高水平,在收获20 d后毒力开始下降,到25 d时明显降低。细胞计数:两种培养方式细胞数均在6×106个/mL以上。

2.2 不同浓缩倍数和纯化

病毒收获液超滤浓缩采用60倍和80倍两种浓度,浓缩液经β-丙内酯灭活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙内酯经37℃水解2 h)后,通过Sepharose4FF层析柱进行纯化。

2.3 冻干疫苗赋型剂的选定

冻干赋型剂采用右旋糖酐、海藻糖、甘露醇、蔗糖配制,经过试验确定最终浓度,为保证疫苗的加入量,4种赋型剂成分的配制浓度接近饱和浓度,经过冻干后的疫苗呈白色疏松状、无塌陷,复溶后为澄明液体,无异物。

2.4 液体疫苗与冻干疫苗的效价比较

结果见表1、表2。

表1 病毒收获液经60倍浓缩后效价结果Table 1 Titer of harvested virus liquid after 60-fold concentration

表2 病毒收获液经80倍浓缩后效价结果Table 2 Titer of harvested virus liquid after 80-fold concentration

冻干疫苗与液体疫苗相比效价下降小于0.5 IU/剂。

2.5 冻干疫苗热稳定试验结果

将冻干后的人用狂犬病疫苗置37℃28 d,然后与在4℃保存的冻干疫苗同时进行效价试验。实验结果见表3、表4。

表3 60倍浓缩冻干苗的热稳定性实验结果Table 3 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 60-fold concentation

表4 80倍浓缩冻干苗的热稳定性实验结果Table 4 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 80-fold concentation

试验结果显示:热稳定试验后疫苗与对照疫苗相比效价下降小于0.8 IU/剂。

3 讨 论

应用15 L细胞培养罐,使用片状载体,加入量为50 g/L,在细胞培养中细胞的密度可以达到6×106个/mL以上,在细胞接种3 d后,再接种狂犬病毒,将细胞生长液换成维持液,再经过3 d后开始收获病毒收获液。在收获病毒收获液的过程中采用批次收获和连续灌流培养收获两种方式进行狂犬病毒收获液的收集,每24 h收获一个细胞培养罐工作体积,可以连续收获25 d(次),病毒收获液的毒力滴度可以达到7.0～8.0 lgLD50/mL之间。

检定合格的病毒收获液经浓缩、灭活和纯化后,加入适量人血白蛋白作为保护剂即为原液,经稀释后即为液体狂犬病疫苗,液体狂犬病疫苗加入赋剂型后,经冻干后即为冻干狂犬病疫苗。

疫苗经效价检定后可以看出,病毒收获液经60倍和80倍2种倍数浓缩后,制备的疫苗效价均可以达规程要求,疫苗的其他各项指标经检定均达到生产规程要求。冻干疫苗与液体疫苗相比效价下降小于0.5 IU/剂,冻干疫苗经热稳定性试验后效价降低小于0.8 IU/剂。

此生产工艺与传统的转瓶生产工艺相比,具有染菌率低、单位体积细胞密度大、所收获的病毒原液毒力滴度高及脱落细胞少等优点。这样,在疫苗的生产中可以提高疫苗的质量和产量,同时可以使生产成本大大降低。本生产工艺与采用微载体的罐培养工艺相比,优点是由于使用的片状载体可以将细胞固定在一个相对平稳的环境中,因此不会受到搅拌系统剪切力的影响而造成细胞脱落。使用微载体时培养罐的搅拌速度一般不超过100 r/min,如果高于这个转速就可能造成细胞的脱落,而采用片状载体进行细胞培养时,搅拌速度可以达到180～220 r/min,从而使各种气体、细胞培养液的交换更加充分,更加有利于pH和DO的调控,同时也具有在病毒收获液中脱落细胞少的优点,有利于疫苗的纯化。此工艺完全适合用于大规模人用冻干狂犬疫苗的生产。

[1] 张永振.中国狂犬病流行病学特征及防治建议[D].全国人畜共患病学术研讨会论文集,2006:64-68.

[2] 李志强,官桂范,王研,等.应用生物反应器连续培养基因重组CHO细胞的研究[J].生物工程学报,1993,9(2):163-165.

[3] 王树君,代长海,张莹,等.用微载体系统培养VERO细胞生产高滴度狂犬病毒液[J].中国生物制品学杂志,2004,17(6):380-382.

[4] 官桂范,李志强,王研,等.30 L生物反应器连续灌流培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究[J].微生物学免疫学进展,1999,27(4):45-50.

[5] 刘国诠.生物工程下游技术[M].北京:化学工业出版社,1993:47-57.

[6] Heath C.,Kiss R.Cell Culture ProcessDevelopment[J].Advances in Process Engineering,2007,23:46-51.

[7] 王妍,李志强,叶世德.应用篮式生物反应器和新型载体连续培养CHO-C28细胞HBs Ag的表达[J].中国生物制品学杂志,1993,6(4):161-163.