Genome shuffling在酿酒酵母菌种选育中的应用

孙红兵,宋 刚,平文祥,葛菁萍

(黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙江哈尔滨 150080)

由于全球可用化石能源的急剧减少以及人类对环境的日益关注,用生物能源替代部分化石能源已经成为一种重要的可再生能源途径。酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)是传统乙醇生产菌,但其发酵性状均是由多基因控制的复杂表型。根据近年来在表型及蛋白质组学方面的研究进展[1],推测酿酒酵母中对乙醇耐受性的基因至少有250个,同时涉及到大量的基因产物及相关的代谢途径,在乙醇对酵母细胞作用机制完全阐明以前,很难采用定向育种、代谢工程或者其他基因工程手段对其进行改造。因此,应用Genome shuffling对酿酒酵母进行改造将会是一种行之有效的方法,尤其是那些具有实际利用价值的工业酵母。Genome shuffling首先是由Stemmer研究小组于1998年提出来的,被誉为菌种表型改进及代谢工程中的一个里程碑事件,Genome shuffling作为一种有效的全细胞工程手段已经被成功地应用在许多重要的工业微生物领域[2]。

1 从原生质体融合到Genome shuffling

Genome shuffling是源于原生质体融合的一种技术。原生质体融合技术是始于20世纪70年代中后期发展起来的一种用于细胞表型改进的方法,但两者最大的区别在于Genomeshuffling使用多亲本而非双亲本,并且进行递推式循环原生质体融合,这相对于经典的诱变育种而言[3],在工作量没有增加的前提下,Genome shuffling将大大增加子代筛选群体内的遗传多样性,从而提高获得优良性状菌株的几率,见图1。

2 Genome shuffling的技术过程

成功的Genome shuffling取决于突变体文库的构建的可靠性、基因重组的效率以及筛选方法的有效性,见图2。

2.1 突变体文库的构建

Genome shuffling的第一步是选择原始菌株,然后构建突变体候选株文库,以这些表型提高的菌株作为Genome shuffling的对象[4]。在构建突变体文库时,一般都会选用多种经典的诱变育种方法对原始菌株进行改进以产生遗传表型的改变,在对有益表型进行选择时,目前选择标准均聚焦在产量或者是对环境耐受性提高等方面,但除此以外,菌株的生长特性也应该是值得关注的一个方面,因为菌株产量或者是对环境耐受性的提高往往伴随着对生长的不利[2],所以,在突变体文库中最好留有野生型的亲本菌株以提高子代的生长性能。

2.2 递推式循环原生质体融合

Genome shuffling采用多亲本递推式循环原生质体融合技术对微生物整套基因组进行重排,递推式循环原生质体融合产生同源重组的几率要比常规原生质体融合高得多,能产生各种各样的突变组合,从而达到快速进化微生物表型的目的[5]。

2.3 选择理想表型

在Genome shuffling的整个进程中,选择有效的方法对递推式循环原生质体融合的子代进行筛选是最为关键也是最困难的一步。对于筛选产酶菌株产量是否提高经常通过生理生化特征来鉴定,比如说,可以在琼脂平板上检测其水解圈、透明圈及抑菌圈的大小[2],这种方法比较直观,效果也较好,但是对于其他菌株的筛选鉴定就显得较为困难。

3 Genome shuffling在酿酒酵母中的应用

Genome shuffling是一种新型而又富有生命力的技术,对酿酒酵母而言,现在主要应用于产量的提高及表型的改进[6],主要表现在乙醇产量的提高、对周围环境耐受性的增强以及改进其他性状。

3.1 提高乙醇的产量

在提高酿酒酵母代谢产物乙醇的产量研究上,2008年,有学者[7]对筛选得到的5株酵母菌ES-1、ES-2、ES-3、ES-4和ES-5(乙醇产量分别为40、51、63、68和70 g/L),以它们为出发菌株,通过原生质体诱变,进行5轮的Genome shuffling,最终获得融合菌株GS4-185,其乙醇产量可以达到142 g/L,远远高于亲本的乙醇产量。2009年,Hou Lihua[1]利用一种新型的Genome shuffling对工业酿酒酵母WT首先进行硫酸二乙酯的诱变,以筛选得到的菌株作为出发菌株,通过3轮的Genome shuffling,从高乙醇浓度的特殊平板上获得菌株S3-10,该菌株显示了对乙醇、葡萄糖及热的多重抗性,其乙醇的产量相对于高密度(VHG)发酵来说,提高到10.96%,发酵时间也从49 h缩短为42 h,而且其发酵性能十分优良,非常有利于生物乙醇的工业化发展。

3.2 增强对周围环境的耐受性

酿酒酵母的最适生长温度大多为30～35℃,这也是大量产生乙醇的最佳温度,经过紫外诱变、化学诱变及原生质体融合等手段进行改造,现在酿酒酵母能够生长的最高温度为45℃,但是目前关于其耐热性的机理还不是很清楚,可其耐热性却又有很重要的应用价值。在乙醇发酵中,酿酒酵母于40℃时产乙醇能力已明显下降或发酵速度减缓,甚至彻底丧失发酵功能,必须配以制冷设备才能维持正常生产,这增加了设备投资和运行费用,故每年酿酒厂不得不支付大量的冷却设备及耗电的费用[8]。由此可见,高温酿酒酵母的选育具有重要的现实意义。同时,在乙醇发酵工艺中,若乙醇浓度过高对酵母菌生长和发酵亦会产生抑制作用。

王灏等[9]以3株酿酒酵母菌f4、f5及f6作为出发菌株,进行2轮Genome shuffling,筛选得到耐高温和耐乙醇性能都较好的菌株R24,在35℃发酵,发酵液中的最高乙醇浓度为12.93%(体积比),比原始出发菌株f4提高了约5%,结果证明通过Genome shuffling的方法能够选育出既耐受较高温度又耐受较高乙醇的菌株,同时也表明该技术的确如原理所阐述的那样,能够将引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中,获得优良菌株,发挥改良菌种的作用[10]。陆筑凤等[11]对茅台酒厂生产用菌AS2109和神舟5号飞船搭载的茅台大曲中筛得的Y14,经过紫外诱变方法和筛选,获得了5个耐性有所提高的正突变株,以这些菌株作为出发菌,再利用Genome shuffling的方法获得了能耐受46℃高温和16%(体积比)乙醇浓度的酵母菌,耐高温和耐酒精能力比亲本分别提高了7%和33%。2009年,研究者[12]对工业酿酒酵母S M-3进行原生质体诱变,通过筛选获得性状有所提高的菌株作为基因重排的出发菌株,再进行3轮的Genome shuffling,得到菌株F34,结果表明,Genome shuffling能将多种有益的突变组合在一起,该菌株能在高达55℃的高温进行生长,在45～48℃时,在48 h内能够完全利用20%(质量体积比)的葡萄糖,产生9.95%(体积比)的乙醇,同时可耐受25%(体积比)的乙醇,这是首次对工业酿酒酵母进行完美的改造,使其既能耐高温又能高产乙醇同时还耐受乙醇,但需要加以改进的就是在高温下其发酵能力受到了一定的限制,同时其产生的乙醇较易蒸发[13]。

3.3 改进酿酒酵母的其他性状

酿酒工业一般要求所使用的酵母具有耐高温、耐乙醇、高产乙醇、糖化力强[8]、能够产香、有较好的絮凝性[14]、能够降解苹果酸[8,14]等优良的生产性状。生产不同产品所需的酵母性状有所不同,但每一种产品的生产都需要具有多种优良性状的菌种,而真正具有多种优良性状的菌株又寥寥无几。因此,应用Genome shuffling实现多种优良性状的整合,构建出理想的酵母菌株,将对酿酒工业的发展具有重要的意义。

4 Genome shuffling的前景展望

Genome shuffling已经成功地应用在乳酸杆菌中提高对酸的耐受性、Streptom yces fradiae中提高泰乐菌素的产量以及在Sphingobium chlorophenolicum中提高对五氯苯酚的降解效率[4,6,12,15]。因此,有理由相信,在酿酒酵母的应用上,该技术一定也可以显示其强大的生命力。有学者预言“Genome shuffling的建立与日益成熟,必将引起传统微生物育种及发酵生产的一场革命[16]。”

[1] Hou Lihua. Improved production of ethanol by novel genome shuffling inSaccharomyces cerevisiae[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2009,160(4)：1084-1093.

[2] Gong Jixian,Zheng Huijie,Wu Zhijun,et al.Genome shuffling：progress and applications for phenotype improvement[J].BiotechnologyAdvances,2009,27(6)：996-1005.

[3] 林峻,施碧红,施巧琴,等.基因组改组技术快速提高扩展青霉碱性脂肪酶产量[J].生物工程学报,2007,23(4)：375-379.

[4] 罗剑.利用基因组改组技术对灰黄霉素产生菌—青霉进行改良的研究[D].硕士学位论文,福建师范大学,2008.

[5] 朱惠,金志华,岑沛霖.纳他霉素产生菌基因组重排育种[J].中国抗生素杂志,2006,31(12)：937-940.

[6] Wang Yuhua,Li Yan,Pei Xiaolin,et al.Genome shuffling improved acid tolerance andL-lactic acid volumetric productivity inLactobacillus rhamnosus[J].Journal of Biotechnology,2007,129(3)：510-515.

[7] Gong Guoli,Wang Changlu,Chen Mianhua,et al.Genome shuffling to improve the ethanol production ofSaccharomyces cerevisiae[J].JournalofBiotechnology,2008,136(S1)：S311-S312.

[8] 蒋宏.酿酒酵母与水生假丝酵母原生质体融合研究[D].硕士学位论文,四川大学,2006.

[9] 王灏,王航.基因组改组技术选育耐高温、耐高乙醇酿酒酵母菌株的研究[J].工业微生物学通报,2007,34(4)：705-708.

[10] 李义勇,张亚雄.基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展[J].中国酿造,2009,(1)：11-14.

[11] 陆筑凤,李超,王昌禄.Genome shuffling技术选育高耐性酿酒酵母[J].酿酒科技,2008,(7)：23-25.

[12] Shi Dongjian,Wang Changlu,Wang Kuiming.Genome shuffling to improve thermo-tolerance,ethanol tolerance and ethanol productivity ofSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology,2009,36(1)：139-147.

[13] Sakanaka Kazunobu,Wen yan,KishiaoMasao,et al.Breeding a fer mentative yeast at high temperature using protoplast fusion[J].Journal of fermentation and bioengineering,1996,81(2)：104-106.

[14] Tan Zhoujin,Yang Haijun,Lin Shu,et al.Protoplast fusion technology and microbial breeding[J].Acta Agriculturae Nucleatae Sinica,2005,19(1)：75-79.

[15] Zhao Kai,PingWenxiang,Zhang Lina,et al.Screening and breeding of high taxolproducing fungi by genome shuffling[J].Science in China Series C：Life Sciences,2008,51(3)：222-231.

[16] Zhang Yingxin,Perry Kim,Vinci Victor A,et al.Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria[J].Nature,2002,415(7)：644-646.