混合培养提高菌株解磷解钾能力的探讨

韩 梅,李丽娜,魏 冉,彭 帅,韩晓日

(沈阳农业大学土地与环境学院,辽宁沈阳 110161)

微生物是土壤肥力的核心,土壤中的微生物不仅数量巨大,而且种类极多,许多微生物对土壤氮、磷和钾等养分的转化和供给起非常重要的作用[1]。氮、磷和钾均是作物生长发育必需的大量元素。根瘤菌可以与豆科植物共生固氮,在生物固氮中占有重要的地位[2]。溶磷菌、硅酸盐细菌(又名钾细菌)能够分解土壤中的固定态磷、固定态钾转化为作物可以直接吸收利用的有效磷、有效钾。同时根瘤菌、溶磷菌、硅酸盐细菌可分泌促生长活性物质促进植物的生长,因此是理想的生物肥料。微生物之间存在着协同、竞争、拮抗、捕食等作用,探讨其具体关系有助于进一步开发微生物单一菌剂及复合菌剂[3]。本试验将所得到的根瘤菌、溶磷菌和硅酸盐细菌3株细菌混合培养,试图了解它们的相互作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种 根瘤菌S-2、磷细菌P-3和硅酸盐细菌K-5,沈阳农业大学土壤与环境学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株拮抗试验 ①培养基(Y MA培养基)：甘露醇10 g,NaCl 0.1 g,酵母膏1 g,K2HPO40.5 g,Rh溶液4 mL,蒸馏水1 000 mL,pH值为6.8～7.0(Rh溶液：H3BO45 g,Na2Mo45 g,蒸馏水1 000mL,pH值为3.0)[4];②拮抗反应测试：将活化后的根瘤菌、溶磷菌、硅酸盐细菌两两交叉划线到同一Y MA培养基上,置于28℃培养箱中培养2～3 d,每天观察交叉点的细菌生长情况,判断有无抑制情况。若交叉点细菌不生长或生长比较差,说明各细菌间有拮抗作用,若交叉点细菌生长良好,则说明各细菌可以共存,相互之间没有拮抗作用,不发生拮抗反应的各菌株可以混合培养。

1.2.2 菌株溶解磷矿粉以及溶解钾长石特性①培养基：甘露醇10 g,NaCl 0.1 g,(NH4)2SO40.5 g,酵母膏1 g,K2HPO40.5 g,KCl 0.2 g,MgSO4·7H2O 1 g,MnSO40.004 g,CaCO35 g,FeSO4·7H2O 0.003 g,CaCl 0.1 g,钾长石粉2.0 g,磷矿粉5.0 g,卵磷脂2.0 g,Rh溶液4 mL,蒸馏水1 000 mL,pH值为6.8～7.0;②试验方法：于250 mL三角瓶中注入100 mL的液体培养基,121℃高压灭菌20 min备用。将在各自培养基培养24 h的3株菌,分别制成菌悬液(调节OD660值,使含菌数在同一水平)接种于Y MA液体培养基。试验共设8个处理：(A)对照(不接种);(B)接种根瘤菌菌液5 mL;(C)接种溶磷菌菌液5 mL;(D)接种硅酸盐细菌菌液5 mL;(E)接种根瘤菌与溶磷菌菌液各5 mL;(F)接种根瘤菌与硅酸盐细菌菌液各5 mL;(G)接种溶磷菌与硅酸盐细菌菌液各5 mL;(H)接种3株菌菌液各5 mL。每个处理3次重复,摇床培养(28℃,160 r/min)3、7、10、15、20 d。4℃(10 000 r/min)离心15 min,离心后取上清液,取5 mL进行有效磷含量测定,取1 mL进行消煮,测定可溶性钾含量。有效磷含量用钼锑抗比色法测定,可溶性钾含量用H2SO4-H2O2消煮后火焰光度计测定。溶磷量及溶钾量均以扣除对照值表示(μg/mL)[3]。

2 结 果

2.1 拮抗

菌株拮抗测试显示：3株菌相互之间均无拮抗反应。

2.2 溶解磷矿粉特性

根瘤菌S-2不具有溶磷能力。溶磷菌P-3和硅酸盐细菌K-5均有溶磷特性,但其溶磷能力有一定的差别。根瘤菌、溶磷菌、硅酸盐细菌单独培养或混合培养后培养液有效磷含量测定结果见表1和图1。

表1 培养液有效磷含量(μg/mL)Table 1 P content in solution(μg/mL)

图1 10 d各处理培养液中有效磷含量Fig.1 Pcontent in solution of different Treatment in the 10th day

将试验中8种处理摇瓶培养3、7、10、14、20 d,分别进行钼锑抗比色,测定磷含量。标准曲线回归方程：y=661.37x-0.012 3,R2=0.998 8。结果表明：横向比较：从接种到第10天随着培养时间的增加P-3的溶磷能力逐渐增强,可溶性磷含量增加了79.02%。10 d后溶磷能力下降,可溶性磷含量下降了36.97%,可见P-3在第10天时发挥最大功效。K-5同样在第10天的时候溶磷能力最强,10 d前的可溶性磷含量增加了73.53%,10 d后下降了25.65%。纵向比较：第10天时S-2、P-3、K-5单独培养或混合培养后培养液有效磷含量。S-2与P-3混合培养溶解磷矿粉的能力增强,组合有效磷含量较溶磷菌株单独培养时显著升高,S-2与P-3大于2菌株分别单独培养时的有效磷含量之和,较P-3单独培养时提高了25.50%。S-2与K-5大于2菌株分别单独培养时的有效磷含量之和,较K-5单独培养时提高了51.54%。然而P-3与K-5其有效磷含量虽较各菌株单独培养时高,较P-3单独培养时提高了26.99%。但未表现出1+1＞2的溶磷效果。这可能与菌体过多,其在空间和营养上存在竞争有关。S-2、P-3与K-5 3菌混合培养时具有1+1+1＞3的溶磷效果,这主要源于3菌株间的协同作用。

2.3 溶解钾长石特性

硅酸盐细菌、根瘤菌和溶磷菌都具有一定的解钾效果,但其解钾能力有一定的差别。根瘤菌、溶磷菌、硅酸盐细菌单独培养或混合培养后培养液可溶性钾含量测定结果见表2、图2。

将试验中的8种处理摇瓶培养3、7、10、14、20 d,分别进行H2SO4-H2O2消煮,火焰光度计测定钾含量。y=8 285.7x+1.071 4,R2=0.999 6。结果表明：横向比较：从接种到第10天随着培养时间的增加S-2的溶钾能力逐渐增强,可溶性钾含量增加了65.03%。10 d后溶钾能力下降,可溶性钾含量下降了53.31%,可见S-2在第10天发挥最大功效。P-3同样在第10天的时候溶钾能力最强,10 d前的可溶性钾含量增加了58.15%,10 d后下降了55.34%。K-5也同样在第10天时溶钾能力最强,10 d前的可溶性钾含量增加了89.39%,10 d后下降了39.96%。纵向比较：第10天时S-2、P-3、K-5单独培养或混合培养后培养液可溶性钾含量。S-2与P-3混合培养溶解钾长石的能力增强,组合可溶性钾含量较硅酸盐细菌菌株单独培养时显著升高,但未表现出1+1＞2的解钾效果。S-2与K-5大于S-2单独培养时可溶性钾含量,但与K-5的可溶性钾含量持平,并无明显的促进作用。同样P-3与K-5的组合也无明显的促进作用。S-2、P-3与K-5 3菌组合虽较各菌株单独培养时高,但未表现出1+1+1＞3解钾效果。这可能与菌体过多,其在空间和营养上存在竞争有关。

表2 培养液可溶性钾含量(μg/mL)Table 2 K content in solution(μg/mL)

图2 10 d各处理培养液中可溶性钾含量Fig.2 K content in solution of different Treatment in the 10th day

3 讨 论

根瘤菌S-2、溶磷菌P-3、硅酸盐细菌K-5解磷解钾能力存在一定差异,但大体均在第10天时解磷解钾效果最好。根瘤菌S-2不具有解磷能力,然而S-2与P-3、K-5两两组合时表现出强大的促进作用,可能是S-2其生长代谢过程中的代谢物具有促进P-3、K-5解磷能力的作用。P-3与K-5的组合未体现出1+1＞2的解磷效果,3菌组合时也并未体现出1+1+1＞3解磷效果,这可能是由于营养及空间上的限制,导致互相之间产生一定的抑制作用,但是仍然是3菌组合时体现出的解磷效果最为明显。根瘤菌S-2、溶磷菌P-3、硅酸盐细菌K-5都具有不同程度的解钾能力。解钾能力：K-5＞S-2＞P-3。S-2与P-3的组合溶解钾长石的能力较这2株菌分别培养时强,但并未体现出1+1＞2的效果。S-2与K-5以及P-3与K-5的组合中S-2与P-3并没有体现出对K-5的促进作用,与K-5单独培养时可溶性钾含量相当。3菌混合培养时也并未体现出1+1+1＞3解钾效果,可能是由于菌体过多在营养和空间上的不足导致的,但总体来说3菌混合培养时解钾效果最为显著。

[1] 孙焱鑫,姚军刑,礼军.解钾菌与解磷菌及固氮菌的相互作用[J].生态学杂志,2001,21(2)：71-73.

[2] 张希涛,康丽华,马海滨.具有解磷能力的相思根瘤菌的筛选[J].林业科学研究,2008,21(5)：619-624.

[3] 孙丽娜.苜蓿根瘤菌与溶磷菌互作及其菌肥对苜蓿生长和品质影响研究[D].兰州：甘肃农业大学,2008.

[4] 徐广.西宁地区三叶草根瘤菌生物学特性及共生固氮效应的研究[D].西宁：青海师范大学,2009.