1株虎源致病性肠球菌的分离鉴定及序列分析

李富祥,唐杨春,宋建领,王金萍,张 健,李华春＊

(1.云南省畜牧兽医科学院,云南昆明 650224;2.云南省野生动物园,云南昆明 650218)

肠球菌为革兰阳性球菌,最初归于链球菌属,直到1984年Schleifer KH等[1]才将其从链球菌属中分离出来作为一个独立的菌属,命名为肠球菌属。肠球菌共包括19个种[2],粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)为其代表种,从临床标本分离的肠球菌以粪肠球菌最为多见,占80%～90%。肠球菌为重要的条件致病菌,可以引起人和动物的心内膜炎,胆囊炎,脑膜炎,尿路感染及伤口感染等多种疾病[3]。近年来,在动物医学方面,已报道了肠球菌引起猪、羊、鸡、鸭等多种动物疫病[4-7],造成重大经济损失,在兽医临床上,由于抗生素的大量使用,尤其是第3代头孢菌素的广泛应用,使肠球菌的感染率不断上升,肠球菌引起的动物疫病也逐渐引起了人们的关注。目前,肠球菌引起老虎等野生动物疫病国内尚无报道。本文报道了1株虎源致病性肠球菌的分离鉴定,并对该菌的生理生化、药敏试验、小白鼠致病性实验、16S rDNA基因序列分析等生物学特性做了系统研究,对肠球菌感染野生动物疫病流行病学具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 来自云南野生动物园病死老虎的肝脏和肺脏。

1.1.2 主要试剂 16S rDNA通用引物由上海生工合成;细菌基因组提取试剂盒购自上海生工;Taq酶购自大连宝生物公司;15k DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司;营养琼脂、细菌生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司;兔血琼脂平板和羊血琼脂平板自制。

1.1.3 实验动物 昆明系小白鼠、兔购自昆明医学院。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 将病料画线接种于营养琼脂平板(加入1%葡萄糖),37℃培养过夜,再挑典型单菌落接种于营养琼脂平板、兔血琼脂平板、羊血琼脂平板和营养肉汤37℃培养过夜。

1.2.2 细菌形态观察 分别挑取营养琼脂平板上单菌落和营养肉汤培养物涂片,革兰染色镜检,观察本菌在固体和液体培养基中的细菌形态差异。

1.2.3 生化鉴定和抗菌药物敏感试验 将本菌纯培养物接种于36种细菌鉴定生化管,观察细菌的生化特性,方法按照使用说明书操作步骤进行。再将本菌纯培养物用灭菌生理盐水稀释后涂布于营养琼脂,按美国临床试验标准研究所CLSI/NCCLS 1999～2005年颁布的抗菌药物敏感试验标准和规定进行试验并判定结果。判定标准为抑菌圈直径在15～20 mm为高敏,10～14 mm为中敏,10 mm以下为低敏,0 mm为不敏感(耐药)。

1.2.4 小白鼠致病性实验和细菌LD50的测定将纯培养细菌稀释于灭菌生理盐水制成菌液,用细菌平板记数法测定菌液的浓度为9×1010cfu/mL,腹腔注射4只小白鼠,0.3 mL/只鼠,并设肉汤作空白对照,记录发病和致死情况,观察本菌对小白鼠的致病性,剖解病死小白鼠,无菌采肺脏、肝脏做细菌分离培养,同时观察病理变化。在测定最小致死量和最大存活量的基础上,再将纯培养细菌原液(9×1014cfu/mL)做10-3、10-4、10-5、10-6稀释后,每个稀释度分别腹腔注射10只小白鼠,0.3 mL/只鼠,观察小白鼠的发病情况,观察14 d,记录病死数,按Reed-Muench法进行计算细菌的半数致死量。

1.2.5 16S rDNA核苷酸序列扩增及序列分析按试剂盒操作说明提取细菌基因组DNA,作为PCR模板,按参考文献[9]报道的16S rDNA引物序列合成一对引物,Pf：5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′(20 bp);Pr：5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′(19 bp)扩增细菌16S rDNA基因片段,50 μL反应体系：ddH2O 38.5μL,10×Taqreaction buffer(Mg2+plus)5μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物各1μL,模板0.25μL,Taq0.25 μL。扩增条件为96℃预变性3 min(94℃30 s,57℃30 s,72℃90 s)30个循环,72℃延伸10 min。扩增产物送上海生工测序,将测序结果与GenBank上其他粪球菌进行同源性分析。

2 结 果

2.1 细菌培养特性

在营养琼脂上形成直径1 mm灰白色小菌落,菌落光滑、湿润、边缘整齐。在麦康凯琼脂上形成较营养琼脂小的菌落,在血琼脂上形成较链球菌稍大的菌落,在液体培养基中呈均匀浑浊生长,也较易形成长链。在绵羊血平皿上不溶血,在兔血平皿上呈α溶血。

2.2 细菌染色特性

革兰染色呈阳性球菌,常成对、单个或链状排列,少数成簇排列形似葡萄球菌,无芽胞和荚膜,液体培养物易形成4～12个长链状。

2.3 生化试验

本菌分解葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、纤维二糖、水杨素、胆汁七叶苷产酸不产气,PYR(吡咯垸酮芳胺酶实验)分解试验阳性,6.5%NaCl肉汤培养能生长;不分解乳糖、棉籽糖、血清菊糖、阿拉伯糖,木糖、山梨醇、肌醇、卫茅醇、侧金盏花醇;MR试验阳性;氧化酶、过氧化氢酶、尿酶、H2S、VP试验、硝酸盐还原、枸橼酸盐、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阴性。

2.4 药敏试验

本菌对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、氯霉素等为敏感(S),对头孢唑啉、头孢噻吩为中介(I),对阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、红霉素、氯霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素等为耐药(R),各药物的抑菌圈直径大小见表1。

表1 分离菌株对药物的敏感性Table 1 Drug sensitivty test of the isolated strain

2.5 小白鼠致病性试验

每只小白鼠腹腔接种2.7×109cfu,在接种菌液后,4只小白鼠均在12 h出现精神沉郁、被毛逆立、站立不稳、呼吸急促、黄色水泻(此症状与发病老虎临床症状相同)等典型临床症状,48 h死亡2只,另外2只小白鼠也在3 d内全部死亡,剖检病死小白鼠可见肠内充满黄色浆液,肝脏重大,肺脏充血、出血。并再次从病死小白鼠肺脏和肝脏分离到相同细菌,表明该株细菌对小白鼠具有较强的致病性。小白鼠接种不同剂量的菌液后,12 h开始出现临床症状,1 d后高剂量组小白鼠开始出现死亡,死亡高峰集中在2～4 d,7 d后停止死亡。各剂量组小白鼠共死亡23只,总死亡率为57%,LD50为109.2cfu,分离菌株LD50计算表见表2。

表2 分离菌株LD50计算表(接种量为0.3 mL)Table 2 The table ofLD50calcualation(Inoculum：0.3 mL)

距离比例=(高于50%的死亡率百分数-50%)/(高于50%的死亡率百分数-低于50%的死亡率百分数)=(92.8%-50%)/(92.8%-36%)=0.8

LogLD50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%的死亡率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-4)=-4.8

LD50=10-4.8/0.3 mL,即将细菌原液(9×1014cfu/mL)稀释104.8后接种300 mL(2.7×109.2cfu/0.3 mL)可使50%小白鼠发生死亡。

2.6 16S rDNA核苷酸序列扩增及序列分析

图1 分离菌株16S rDNA核苷酸扩增产物电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR-amplified 16S r DNA

扩增片段大小在1 000～15 000 bp之间与预期片段1 415 bp大小相符,扩增正确。将扩增产物送上海生工测序,将测序结果与GenBank上其它粪球菌进行同源性分析,结果表明扩增序列与GenBank公布的致病性肠球菌(登陆号为EU285587)同源性为100%,进一步证实该菌株为致病性肠球菌。

3 讨 论

粪肠球菌长期以来一直被认为是条件致病菌,在医学上是第二大院内感染疾病,已受到高度重视。但在兽医临床上,最近几年才引起人们的关注,已报道了肠球菌引起猪、羊、鸡、鸭等多种动物疫病。研究表明,致病性菌株和非致病性菌株存在本质区别,Shankar[10]提出粪肠球菌存在着毒力岛基因结构。Leavis H[11]也在屎肠球菌中发现一个毒力岛类似结构,由7个与细菌调节、毒力和抗生素抗性有关的ORF(溶血素的基因(cyl)、表面蛋白(esp)、心内膜炎抗原(efaA)、明胶酶(gelE)等)聚集在一起形成。肠球菌毒力岛的存在与其致病性密切相关,后来Coburnd PS[12]研究进一步表明毒力岛基因的转录和表达是强弱毒株的本质区别,毒力岛基因前的调控因子PerA在此过程中发挥重要作用,决定着肠球菌的致病性。毒力岛的发现,使人们认识到粪肠球菌和屎肠球菌致病性正在发生着某种变化,这也是肠球菌感染越来越受关注的原因。本菌能使实验动物小白鼠致死,其LD50为2.7×109.2cfu/0.3 mL,表明本肠球菌分离株对此小白鼠有强致病性,但本菌毒力岛基因有待进一步研究。

该分离菌株对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、氯霉素等敏感(S),对头孢唑啉、头孢噻吩为中介(I),对阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺甲唑、红霉素、氯霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素耐药(R),本菌对大多数抗生素高度耐药,与文献报道的有所差异[7,13],肠球菌耐药性的改变也与毒力岛基因的改变密切相关。

云南野生物园2只老虎相继发病,临床表现为：黄色水样腹泻,体温升高,呼吸困难,食欲废绝,消瘦,用第3代头孢和卡那霉素治疗无效,1只老虎发病3 d后死亡,剖解无菌取肺脏和肝脏,接种营养琼脂平板,分离到该细菌。根据药物敏感结果,选用敏感药物青霉素和氨苄西林对另1只老虎进行治疗,治疗4 d后老虎迅速恢复健康,取得非常满意的治疗效果。另外,在本菌的小白鼠致病性实验中,小白鼠接种本菌后也出现了与病虎相似的临床症状,即黄色水样腹泻,体温升高,呼吸困难,并于第2天全部死亡,进一步证实了老虎病因是肠球菌感染,本文报道的粪肠球菌感染老虎并导致老虎死亡在国内尚属首次。

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