下颌牵张成骨中应用神经生长因子对神经损伤修复的作用

杜兆杰,雷德林,王 磊,曹 健,张雅博,张 圃,马 秦,程晓兵

(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,陕西西安 710032)

牵张成骨技术(distraction osteogenesis,DO)又称为“自体性骨组织工程”,是 20世纪 50年代由前苏联学者 Ilizarov[1]发展和完善并用于矫治各类四肢长骨畸形的一种方法,90年代后开始应用于口腔颌面外科域[2],且发展迅速,已成为这一领域的研究热点之一。下颌骨有特殊的解剖结构:下齿槽神经(inferior alveolar nerve,IAN)位于骨性下颌管中,在牵张器植入、下颌骨牵引延长的过程中受到创伤和牵拉,这在一定程度上造成了 IAN的损伤[3-5]。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是 1952年Levi.Montalcini最先在研究鸡胚的神经发育过程中发现的。NGF对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持起调控作用。现已证实 NGF是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素,是兼有神经营养因子与促神经突起生长因子双重作用的蛋白质[6],全身应用 NGF在治疗中枢及外周神经损伤中取得了明显的效果,且已应用于临床[7-9]。很多研究证实,NGF及其受体在牵张成骨的过程中出现高表达,而且与牵张应力有着密切关系。随着牵张应力的消失,NGF及其受体的表达很快降低并恢复到正常水平[10-12],这提示神经损伤在固定期的自我修复过程中,应用外源性 NGF很可能会加快神经修复。本研究组的既往研究发现,DO中牵张区局部应用 NGF能明显促进 IAN的恢复[13],但全身注射NGF这种更安全的应用方式,是否能促进下齿槽神经的修复仍未明确。因此在本实验中,我们在牵张器植入后当天给予全身注射 NGF,检测兔 IAN的感觉神经动作电位(sensory nerve action potential,SNAP),监测牵张成骨术前及术后不同时期 IAN功能的变化,研究全身注射 NGF对下颌骨牵张成骨术中 IAN功能的影响。

材料与方法

1 实验动物及分组

成年新西兰白兔 52只,由本校实验动物中心提供,雄性,口颌系统无异常,体重 2.8～3.2 kg,实验前分笼适应性饲养 1周,普通饮食。将兔随机分为9组 ,Ⅰ组(空白组,4只)和 A组(肌注 NGF,牵张结束即刻组),B组(肌注 NGF,固定期 1周组),C组(肌注 NGF,固定期 2周组),D组(肌注 NGF,固定期 4周组),E组(肌注生理盐水,牵张结束即刻组),F组(肌注生理盐水,固定期 1周组),G组(肌注生理盐水,固定期 2周组),H组(肌注生理盐水,固定期 4周组),每组6只。除Ⅰ组未进行任何干预外,其他 8组均行骨牵张术。

2 牵张器

所用的内置式双侧下颌钛牵张器由西安中邦钛生物材料公司与本课题组共同研制(图 1)。所应用的因子是人胚胎提取的 NGF,由第四军医大学生化中心提供。

图1 下齿槽神经及牵张器

3 手术过程

兔术前 30分钟肌注青霉素 30万 U,给予肌注氯胺酮 50mg/kg,静脉注入苯巴比妥钠 40mg/kg,全麻成功后,颌下三角区备皮。取仰卧位固定四肢并常规消毒铺巾后,向颌下三角区局部注射含有 1:200 000肾上腺素的 1%利多卡因 2.5ml。沿颌下三角正中切开皮肤和皮下约 3cm,显露双侧下颌下缘,切开骨膜并沿其深面向颊侧翻瓣,暴露并保护好颏神经,行牵张器植入。在截骨过程中,一直高度注意保护好下齿槽神经血管束,而且完全固定牵张器后的骨断端未见明显移位,避免了下牙槽管断端对IAN的刺激。创口反复冲洗后将骨膜复位缝合,分层严密缝合皮下和皮肤。将上前牙磨短至原牙冠的一半长,以减少将来下颌前徙时上切牙对下颌牙龈的刺激,以后每周调磨上前牙 1次。

4 术后处理

兔完全苏醒后送回笼中,严密观察并记录其精神、饮食和体重情况。术后伤口每日清洁消毒并涂红霉素软膏 2次。术后 4天内肌注青霉素,30万U/12h。术后即分别给予肌注 NGF 0.6μg/d×20天和相当量生理盐水。经过 4天的延迟期后,各组均按照 0.5mm/12h的速度连续牵张,总距离 10mm。

5 神经电生理检查

分别在牵张完成时,固定期 1、2、4周行 IAN和SNAP检测。兔麻醉后取仰卧位,存在角膜反射,安静不动,室温 20～22℃,颌下三角区刮毛备皮。沿颌下三角正中切开皮肤和皮下约 3cm,显露双侧下颌下缘,向颊侧翻瓣,暴露并保护好颏神经。取出牵张器,在下颌骨颊侧颏孔区至下颌骨下缘沿 IAN的走行两侧,涡轮机钻头开辟 2条平行沟槽,咬骨钳轻轻去除颊侧骨板,玻璃分针小心游离 IAN,期间持续滴石蜡油保持 IAN湿润。用一直径约为 3cm钢圈与皮肤两侧切缘缝合形成油槽,以容纳石蜡油,使IAN处于石蜡油环境中。颏孔端 IAN置双极电极作刺激电极,下颌孔端置另一双极电极作记录电极并固定之。在刺激和记录电极间置一针电极接地(图2)。以细电压单刺激的模式,刺激波形为方波,波宽0.5ms,延时 5.00ms,无叠加,起始刺激电压为 1V,逐渐增加刺激强度直到引出最大稳定动作电位。刺激伪迹到动作电位第 1个波峰为潜伏期,峰-基线值为波幅。每只兔的双侧 IAN测量结果取平均值后进行记录。

图2 油槽及电极的放置

结 果

在 48只接受手术的实验兔中,有 3只(B、C、F组各 1只)在牵张期发生颌下区脓肿,后消瘦死亡,故被排除后续研究。其余 45只均耐受手术并保持健康状态。在整个实验过程中,健康兔的体重损失量都 ＜12%。实验兔在手术后的前 2天内仅对软食感兴趣,精神欠佳。而到第 3天,开始习惯牵张器,精神基本恢复到术前状态并开始进食普通干草饲料。牵张结束时,所有兔的下颌均明显前凸。

SNAP检测结果显示,正常未进行干预组(Ⅰ组)IAN波幅为 0.45mv,延迟期为 1.49ms。牵张结束时、固定期 1、2、4周时 NGF组的波幅均高于对照组;牵张结束时、固定期 1、2、4周时 NGF组的潜伏期均低于对照组(表 1,图 3、4)。

应用 SPSS10.0软件包进行 student t检验,分析NGF组与对照组之间波幅和潜伏期的差异。P＜0.05为有统计学差异。在牵张结束时、固定期 1周两组之间的波幅和潜伏期无统计学差异,而固定期2、4周 NGF组的波幅和潜伏期均显著高于对照组(P＜0.05)。表明,牵张成骨中下齿槽神经在固定期 2、4周的神经功能好于对照组。

表1 两组波幅及潜伏期(±s)

表1 两组波幅及潜伏期(±s)

分组 波幅(mv)NGF组 对照组P 潜伏期(ms)NGF组 对照组P牵张结束 0.20±0.045 0.17±0.036 0.5043 1.96±0.661 2.02±0.629 0.2522固定 1周组 0.27±0.031 0.24±0.044 0.0554 1.80±0.370 1.89±0.173 0.0723固定 2周组 0.31±0.018 0.26±0.025 0.0163 1.78±0.262 1.85±0.244 0.0358固定 4周组 0.37±0.066 0.31±0.034 0.0349 1.75±0.221 1.83±0.192 0.0305

图3 NGF组 SNAP波形(横箭头为延迟期,纵箭头为波幅)

图4 对照组 SNAP波形(横箭头为延迟期,纵箭头为波幅)

讨 论

牵张成骨技术已经成为一种治疗下颌骨畸形或缺损的重要方法。NGF是 20世纪 50年初由 Levi.Montalcini在小鼠肉瘤细胞内发现的第 1个神经营养因子,通常称为 7sNGF。NGF对中枢和外周神经系统的生物效应是维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化、成熟以及发挥功能,是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素。有研究认为未成熟的感觉神经含有大量的 NGF受体,有 NGF依赖性,直接影响到它的发育和成熟。无论是局部注射或全身注射外源性的 NGF都能起到防止神经切断术后感觉神经细胞的死亡。尽管成熟的感觉神经已经不及未成熟神经依赖于 NGF,但仍然具有 NGF受体,而且能够作为靶原型逆向营养因子影响上一级神经元,表明 NGF在成熟的感觉神经中依然起到很大的作用[14]。

很多研究已经证实了局部应用 NGF修复外周神经(包括 IAN)的良好效果。同时 Eppley等[15]在应用 NGF修复兔下牙槽神经缺损时还发现再生的神经轴突周围有新生骨质生成。研究表明,NGF可能通过如下 3种途径促进成骨:(1)诱导感觉和交感神经纤维长入骨痂,感觉和交感神经纤维在正常骨代谢和骨折愈合中发挥重要的作用,丧失这两种神经纤维支配的骨组织会表现为钙化不良或骨质疏松,而 NGF正是促进这两种神经纤维发育和再生的主要因子之一[16];(2)直接促进成骨细胞的分化并抑制其凋亡[15];(3)促进局部组织血管生成[17]。但是局部注射存在以下不足之处:局部注射势必要对牵张区造成二次创伤,可能造成局部的物理损伤、炎症、疼痛甚至引起感染等潜在的并发症;局部注射的生长因子代谢快,能暂时形成有效的浓度,但是持续时间不长,虽然缓释载体的应用一定程度上维持了局部注射生长因子的作用时间,但是也存在材料的降解产物反应等诸多问题。全身注射 NGF不仅能够避免上述医源性损伤的出现,而且除了直接作用于牵张区外,还可能通过作用于中枢促进外周神经的恢复,在体内维持有效的作用时间。另外,全身注射 NGF还有方法简便、不良反应小的优点,而且从心理上更容易被患者接受,可作为一种辅助治疗手段,有广泛的临床应用前景。近几十年来国内外对全身注射 NGF的作用机制和临床应用进行了颇多研究,陈燕涛等[18]在对 48例周围神经损伤患者的治疗中发现,全身应用 NGF对周围神经损伤的恢复有显著的促进作用,同时患者疼痛和乏力症状的改善要明显优于对照组。韩汝政等[19]用NGF治疗颅神经损伤 70例(肌内注射 NGF)与对照组(常规支持疗法)相比,痊愈率、有效率均高于对照组,并能显著缩短病程,早期应用更佳。张素爱等[20]全身应用 NGF对 98例面神经炎的患者进行治疗,结果显示 NGF对面神经功能的恢复在早期即具有促进作用,且随疗程延长,疗效进一步增加,NGF配合常规治疗明显缩短面神经炎病程,改善预后,并具有不良反应少等优点。Santos等[21]在全身应用 NGF对大鼠烧伤的研究中,证实 NGF不仅能防止外周神经元的死亡而且还能降低血管通透性和血液黏稠度。综上所述,全身应用 NGF对中枢神经、外周神经、运动神经或是感觉神经损伤的修复都有显著的促进作用,而且能不同程度减轻患者的痛苦。

下齿槽神经走行于狭窄的骨性下颌管,下颌骨截骨、牵张器安装、骨断端的移位以及对神经的拉伸都有可能对 IAN产生直接的损伤[4]。牵张成骨中,由于截骨术后组织渗出、组织的低氧、牵张过程中对周围软组织的延长势必导致牵张区压力的大大增加,动静脉回流受阻,从而对 IAN造成间接的损伤,类似于正中神经的“腕管综合征”[22]。然而下颌骨的牵张是造成 IAN损伤的最主要因素,牵张中不仅要延长下颌骨及其周围肌肉等软组织,重要的是在牵张的同时对 IAN也进行了延长,虽然 IAN有一定的可塑性,但是依然会造成 IAN的损伤甚至是不可逆的损伤。Rostcam等[23]认为牵张成骨是造成 IAN损伤的机械因素,即使以 0.5mm/12h的速度牵张仍然会导致 IAN的损伤。为了能促进 IAN的修复及下颌骨的成骨并缩短 DO周期,NGF作为经典的促神经修复因子,其固有的修复 IAN和促进成骨作用愈加受到重视。

牵张过程中对 IAN的延长导致的髓鞘崩解和巨噬细胞的入侵,牵张区的各种内源性因子表达明显增高,随着牵张结束这些因子逐渐恢复到正常水平[11]。因此,外源性因子的最佳干预时机应该选在牵张成骨的固定期。但是同时参考临床上治疗外周神经损伤的时机、方法、剂量及疗程[18-20],为了充分的发挥 NGF的作用,我们在牵张器植入术后立即给予肌注 NGF,每日 1次,直到固定期 1周结束。

近两个世纪,神经电生理的方法检测下牙槽神经的功能,在临床和实验中已经得到了广泛的应用,神经电生理的方法无论在敏感性还是特异性上有着独到的优势[4,24]。近年来大量文献证实,用诱发神经动作电位的方法能很好的检测在牵张成骨中各个时期神经的受损情况[4]。本实验采用 BL-420F生物功能实验系统及检测设备诱发并记录 IAN的SNAP,波形稳定,重复性好,结果可靠。在 SNAP检测中,波幅降低说明有一定数量的神经纤维断裂、轴突缺失;潜伏期延长则说明有节段性轴突脱髓鞘变,神经纤维传导速度降低,由此可反映神经的功能。实验中我们采取完全解剖游离 IAN的方法,排除了周围组织对检测结果的影响,能充分反映 IAN的功能。我们发现,在牵张结束时、固定期 1周,虽然全身注射 NGF组 IAN的 SNAP波幅高于对照组,延迟期低于对照组,但没有统计学差异。而固定期2、4周全身注射 NGF组 IAN的 SNAP波幅明显高于对照组,延迟期明显低于对照组(P＜0.05),在统计学上有显著差异,与王晓霞等[3]、Makarov等[4,5]的研究相符。数据表明,在牵张结束时及固定期 1周,可能由于牵张应力等因素诱发的内源性 NGF及其受体明显表达增高,虽然牵张完成应力消失,但是牵张区的内源性因子还会保持一定的水平,因此此期间外源性 NGF对 IAN损伤的修复作用并不明显。而到固定期 2周后随着刺激因素消失和代谢作用,内源性的 NGF表达显著降低,全身注射 NGF能维持外源性 NGF在体内的浓度,持续发挥修复 IAN损伤的作用。

总之,全身注射神经生长因子有利于牵张成骨中下齿槽神经功能的恢复,这有望为临床上减少DO治疗的神经并发症提供一种有效的方法。

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