使用漆酶/介体系统除去不同类型纸浆中的亲脂性抽出物

使用漆酶/介体系统除去不同类型纸浆中的亲脂性抽出物

所谓树脂问题是指木材和其他的木素纤维素材料中的亲脂性抽出物在制浆造纸过程中产生的不利冲击。本文采用漆酶/介体系统进行树脂的生物控制，并对漆酶催化处理的可行性进行评价。为了这一目的，我们以1-羟基苯并三唑作为氧化还原介体，采用从担子菌类中的Pycnoporus硃红菌素中提取出的高氧化还原电位的漆酶来处理三种不同类型的浆，三种浆分别代表三种不同的原材料制浆过程，它们是桉木硫酸盐浆、云杉热磨机械浆和亚麻苏打-蒽醌浆，然后再用气相色谱和气相色谱-质谱联用分析酶催化处理的浆中的亲脂性抽出物，研究结果表明，漆酶/介体系统处理法可以完全或者大部分地除去树脂引起的亲脂性化合物存在于不同浆中的问题，它包括（1）桉纸浆中游离和共轭的谷甾醇；（2）云杉浆中的树脂酸、甾醇酯和甘油三酯；（3）亚麻浆中的甾醇和脂肪醇。浆中甾醇的氧化过程中会发现有不同量的游离和共轭的7-氧甾醇作为中间产物生成。因此，用漆酶/介体系统处理阔叶木、针叶木和非木材植物的纸浆，被认为是一种去除树脂产生的亲脂性化合物的有效方法。

1 介绍

可从木素纤维素中抽出的非极性亲脂性抽出物,在制浆造纸过程中会引起技术、经济和环境问题，即通常所说的树脂问题。在整个制浆造纸过程中，不同的亲脂性抽出物可以导致树脂问题，这取决于它们的化学性质以及使用的制浆方法。全无氯漂白的使用代替了原始的无元素氯漂白，更加重了树脂问题，这是因为全无氯漂白试剂与亲脂性抽出物有较低的反应活性。 树脂沉积在纸浆中会导致浆和纸的质量下降，沉积在造纸设备中需要停车冲洗。

传统上，树脂沉积物可通过剥皮，原木和木片储藏或加入物理化学试剂使其减少。然而，这样的费用是很高的，而且这样产生的效果往往不能够令人满意。作为替代物，用酶或微生物处理的生物技术除去抽出物的应用已被提出。然而，可用的商业制剂不是完全有效的，因为他们基于酶（脂肪酯）或主要水解的甘油三酯的微生物。除脂肪酶之外，甾醇酯酶也已被建议采用。然而,游离甾醇和甾醇酯一样会产生问题。因此,解决由不易水解和生物降解的亲脂性抽出物产生的树脂问题的新方法仍然是需求的。

漆酶处理针叶木浆模型过程用水的研究结果表明，亲脂性抽出物发生了改性。与脂肪酶和甾醇酶相比，漆酶是氧化酶，主要作用于酚型化合物。然而，漆酶/介体系统的使用增加了漆酶在木素降解和其他化合物中的电势。尽管漆酶/介体系统处理在木素上的作用被认为是有选择性的，但是它仍然一定程度地氧化了纤维素。然而，这种氧化被证明仅仅是部分可逆的 （处于还原态的可能恢复原来的黏度）。漆酶/介体系统作用于浆中木质和漂白方面已经有许多研究。然而，有关漆酶/介体系统对亲脂性抽出物的最终作用的研究却很少。在这篇文章中，研究漆酶/介体系统处理除去木材（包括阔叶木种和针叶木种）和非木材植物纸浆（包括机械和化学法处理）中的亲脂性抽出物的适用性，使用的是从解木素的真菌Pycnoporus硃红菌素中提取出的漆酶，它是一种人造氧化还原介体。

2 材料和方法

2.1 纸浆

桉木（Eucalyptus globulus)硫酸盐浆取自西班牙Pontevedra ENCE造纸厂。未漂（褐色）桉木浆由硫酸盐制浆经氧脱木素后取样，卡伯值为14.2，ISO白度为41.2%。挪威云杉未漂热磨机械浆（TMP）取自赫尔辛基 （芬兰）UPMKymmene浆厂头道磨浆，ISO白度为63%。经苏达蒽醌蒸煮的未漂亚麻 (Linum usitatissimum)浆是由在Tortosa（西班牙）的CELESA厂提供，卡伯值为11，ISO白度为37%。

2.2 真菌漆酶和介体

处理浆料的漆酶由Beldem(Andenne,比利时)提供。它是从一种产漆酶很高的菌株Pycnoporus硃红菌素中获得的。漆酶活性通过在pH值为5，温度为24°C， 浓度为0.1M的乙酸钠中氧化5分钟，2，2′-连氮基-双 (3-乙基苯并噻唑基-6-酸性硫酸基酸)(ABTS， 取 自 Roche)为 阳 离 子 自 由 基 l(ε436 29，300 M-1cm-1) 来测定。 每分钟转化为 1 μmol，ABTS的量定义为一单位活性。1-羟基苯并三唑是从Sigma-Aldrich获得的。

2.3 用漆酶/介体系统处理纸浆

200 g绝干浆，浆浓为10%，大气压为6kg/m3，浆处理在4L不锈钢反应器中进行。云杉热磨机械浆是在大气压下通入氧气进行处理的，酶用量是20u/g浆。1-羟基苯并三唑用量是绝干浆重量的1.5%，pH值为4，温度是50℃，时间为2小时。评价酶催化处理作用的其他平行实验中的一组是条件相同但不加酶也不加介体。另外有一组处理中加酶不加介体，还有一组是只加介体。

2.4 浆和滤液中的亲脂性抽出物

酶处理的纸浆和空白样，经过滤后在40℃下干燥，分别用丙酮萃取8小时，用甲基叔丁基醚（MTBE）抽提处理液试样，然后分析调查从浆中最终释放出的脂质，所有的抽出物通过蒸发烘干重新溶解于氯仿中，用气相色谱法和气相色谱-质谱联用来分析其中的亲脂性抽出物，所有的丙酮和MTBE抽出物都是完全溶于氯仿的。这揭示了它们的亲脂性质。双三甲基硅、三氟化酰胺（取自supelco）以吡啶形式出现被用来为三甲基硅的衍生物作准备。

2.5 GC（气相色谱）和GC/MS（气相色谱一质谱联用）分析亲脂性抽出物

GC（气相色谱）分析抽出物是用Agilent 6890N Network GC系统用一个短丝石英毛细柱 (DB-5HT，5 m ×0.25 mm I.D.，0.1-μm 镜厚)来自于J&W研究科学所。温度从100°C开始，保持一分钟后以每分15℃的速度升至350℃，恒温3分钟。注射器和火焰离子化检测器的温度分别控制在300℃和350℃。所装气体是氦，喷速为5毫升/分钟。注射器要密封无裂缝。峰值是通过GC色谱范围测定的。标准化合物的混合物（包括十八烷、十六醇、棕榈酸、脱氢枞酸、甾醇、7-氧胆甾醇、谷甾醇3-β-D-吡喃半乳糖苷、胆甾醇油酸盐和三十七烷（triheptadecanoin）被用来制定亲脂性抽出物定量的曲线。所有情况下相对系数都高于0.99。将两个平行测定所得数据求平均值。所有情况下，两次平行测定的标准偏差都低于平均值的10%。当有些峰值重叠（如云杉抽出物中的脂肪酸和树脂酸），用单离子GC/MS色谱 （如下）连同GC分开这些整合。

GC/MS分析是用安装了一个离子阱检测器(Varian model Saturn 2000)的Varian模型星3400GC进行的。GC使用了一个如上所述相同的媒介长度(12 m)的毛细管柱。烘箱被以10°C/min的速度从120°C（恒温 1min）加热到 380°C（恒温 5min）。 输送管控制在300°C。喷射器以200°C/min的速度加热，使温度从 120°C（0.1min）到 380°C，恒温直到分析结束。氦被用来做为运输气体，速度为2ml/min。化合物被鉴定出是通过与Wiley and NIST图书馆比较质谱得出的。其他比较包括碎片质谱法，及与标准值比较。

图1化合物的化学结构代表了存在于纸浆中的主要植物酸种类，分析如下：棕榈酸（a）；脱氢枞酸（b）；n-二十八（碳）醇（c）；菜油甾醇（d）；谷甾醇（e）；豆甾烷醇（f）；7-氧代谷甾醇（g）；豆甾-3，5-二胺-7-酮（h）；谷甾醇 3-β-D-吡喃半乳糖苷（i）；7-氧谷甾醇 3-β-D-吡喃半乳糖苷（j）；谷甾醇亚油酸盐（k）；三亚油精（l）。

3 结果

三种未漂纸浆分别代表三种不同的木素纤维素材料：阔叶木（桉）、针叶木（云杉）和非木材（亚麻），也代表不同的制浆过程（硫酸盐法制浆，热磨机械浆和亚麻苏打—蒽醌浆浆）这三种浆用从担子菌类Pycnoporus硃红菌素中提取出具高氧化还原电位的漆酶处理，其中加入氧化还原介体HBT。和同步平行实验中未加酶的相比，用漆酶/介体系统处理不同的浆都会影响所有主要的脂类。相比之下，只用漆酶处理的浆中没有发现脂类的改性。

3.1 用漆酶/介体系统处理桉木硫酸盐浆

空白试样和漆酶/介体系统催化处理的桉浆试样中主要亲脂性化合物含量如表1所示。以游离和共轭形式（苷和酯）存在的甾醇是主要的化合物。一些类固醇烃、类固醇酮（比如豆甾-3，5-二胺-7-酮和7-氧代谷甾醇）和一些游离脂肪酸被鉴别出。

表1 空白试样和漆酶/介体系统催化处理桉浆中亲脂性抽出物的组成（mg/kg浆）

表1告诉我们用漆酶/介体系统处理几乎完全除去了桉浆游离甾醇、甾醇酯和谷甾醇3-β-D-吡喃葡萄糖。桉浆中80%以上以游离甾醇表现出来的谷甾醇被完全除去，只有少量的豆甾醇存在于处理后的浆中。另一方面，我们发现漆酶/介体系统处理后的浆中豆甾-3，5-二胺-7-酮、豆甾-3-酮，尤其是7-氧代谷甾醇的量有所增加。同时7-氧代谷甾醇（处理的浆中类固醇酮72%），我们也发现双-不饱和酮（豆甾-3，5-二胺-7-酮）和苷（7-氧代谷甾醇和3-β-D-吡喃葡萄糖）的量显著增加。

3.2 用漆酶/介体系统处理云杉TMP浆

空白试样和漆酶/介体系统催化处理的云杉TMP浆试样中主要亲脂性化合物含量。如表2所示。在云杉热磨机械浆中，亲脂性抽出物的组成成分不同于桉浆云杉浆中存在很高含量的甘油三酯，甾醇酯和树脂酸。除此之外，云杉浆中含有较少量的脂肪酸和游离甾醇（菜油甾醇和谷甾醇），还含有少量脂肪醇、类固醇酮和甾醇苷。

表2 空白试样和漆酶/介体系统催化处理云杉浆系统中亲脂性抽出物的组成（mg/kg浆）

表2说明，酶催化处理去除了大部分的甘油三酯、甾醇酯和甾醇苷。酶介体处理对树脂酸和游离甾醇的去除效果明显。以上一些脂类不能够被漆酶/介体系统处理过程完全除去，这与云杉浆的处理条件（在大气氧下进行）有关。最后，脂肪醇和脂肪酸与其它亲脂性化合物相比被除去的程度很低。漆酶/介体系统处理后，氧化7－氧代菜油甾醇和7－氧化谷甾醇还有双不饱和酮、麦角甾烷－3，5－二胺－7－酮和豆甾烷－3，5－二胺－7－酮增多，这种情况在酶催化处理桉浆时也会发生。虽然没有单独进行测量，但在处理的云杉浆中发现了7－氧代脱氢枞酸。

通过对同步试验中只用酶处理的浆及所得液体的分析，证实了漆酶/介体系统处理云杉TMP除去亲脂性抽出物的潜能。这些分析表明在没有酶的控制体系中，浆中只有很小百分比（5%的谷甾醇，4%的甾醇酯和4%的甘油三酯）的脂类释放到处理系统的液体中。然而，在酶处理过程中这些脂类就被降解了。在对桉和亚麻浆处理所得液体进行研究时，我们也得到同样的结果，那就是处理后亲脂性抽出物的含量减少了。

3.3 用漆酶/介体系统处理亚麻苏打－蒽醌浆

空白试样和漆酶/介体系统催化处理亚麻苏打－蒽醌浆中主要亲脂性化合物含量如表3所示。亚麻浆中脂类馏分的组成也与另外两种浆不同。主要的化合物是从二十二烷醇到三十二烷醇的脂肪醇。鉴别出很大量的游离甾醇和甾醇苷，也有少量的类固醇酮和蜡类（脂肪酸类和脂肪醇类的酯）存在。

表3表明漆酶/介体系统处理完全除去了原来存在于亚麻浆中的三种甾醇（谷甾醇、菜油甾醇和豆甾烷醇），然而在处理浆中有一定量的氧化化合物（7-氧代谷甾醇、7-氧化菜油甾醇和7-氧代豆甾烷醇还有个别的双-不饱和酮，麦角甾烷－3，5－二胺－7－酮和豆甾烷－3，5－二胺－7－酮）出现。 同时，三种原来的甾醇苷（甾醇，菜油甾醇和豆甾烷醇3-β-D-吡喃葡萄糖）也完全被除去，只有少量的7-氧代甾醇苷出现，脂肪醇和链烷烃也被很大程度的除去，虽然它们比浆中其它亲脂性化合物对漆酶介体作用抵抗得更多。此外，没有很好处理的峰值的混合物和工业过程中使用的消泡剂在酶处理过程中也被除去了。

表3 空白试样和漆酶/介体系统催化处理亚麻浆中亲脂性抽出物的组成（mg/kg浆）

4 讨论

目前的研究表明漆酶/介体系统可以有效地除去不同来源的纸浆中存在的大多数脂类。这是相比较而言没有预测到的结果，因为酶催化系统作用于顽固性植物脂类在此之前是没有报道的。

漆酶/介体系统在除去甾醇 （减少95%～100%）方面是很有效的，也包括游离的谷甾醇、谷甾醇苷和脂肪酸酯，这些是桉木硫酸盐浆中最典型的脂类。这些化合物在桉木的亲脂性抽出物中存在，它们在蒸煮和氧前漂时仍存在，是制浆过程中树脂问题的起源。在它们中，饱和的豆甾烷醇对漆酶介体系统作用的顽固性要大于不饱和谷甾醇。据报道，豆甾烷醇对氯二氧化物作用的抵抗很大。在处理过程中桉浆中的类固醇酮量的增加说明它们是类固醇的氧化产物，原始桉浆中已经存在的少量7-氧代谷甾醇是在制浆和氧气去木质作用中形成的。氧衍生物存在的增加是与漆酶介体处理的氧化性质相合的，这是一个金属酶催化的氧反应。

就云杉TMP浆而论，三种主要的脂类的树脂问题（甘油三酯、树脂酸和甾醇）在可变效率（65%～100%）内被除去。就桉浆而言，漆酶/介体系统除去了大部分甾醇，这在云杉浆中主要以脂肪酸酯状态存在。类固醇酮的最后含量是低的，这表明它们的形成主要是在氧化酶攻击游离甾醇的过程中。在两种其它脂类针叶木和它们的机械浆中，甘油三酯通过漆酶/介体系统处理被影响的程度 （减少90%以上）高于树脂酸（70%以上）。树脂酸造成困难的原因在于它们对降解的抵抗性以及它们中一些所具有的高毒性。用漆酶单独除去针叶木制浆白水中的脂类已有报道，但这种结果与漆酶/介体系统处理除去的较大的量相比是易变的。树脂问题在非木材植物浆方面的资料少于在木材浆方面的资料，但是亲脂性抽出物仍然是制浆过程中树脂问题产生的原因，尤其当更多合理的措施被采用之前。漆酶/介体系统处理几乎完全除去亚麻浆中的甾醇，它们主要以游离和糖基的形式存在，这正如前面讨论的桉浆和云杉浆，而且浆中典型的重要百分比的醇也被除去。有趣的是大部分亚麻浆中被证实是包含在树脂沉积物中的消泡剂在酶处理过程中也消失了。以氧化还原介体形式存在的Pycnoporus硃红菌素，它在亚麻和桉浆中起着脱木素和漂白作用，它的有效性已有报道。在本文中我们证明可以使用漆酶/介体系统第一次同时除去有害脂类和木素。分析不同浆中存在的主要脂类，包括游离和共轭谷甾醇、甘油三酯、树脂酸和脂肪醇都被很大程度地除去了 （有时是完全除去）。用漆酶-HBT除去树脂导致几种形式氧衍生物的形成，这些衍生物在原始浆中不存在或即使存在量也很少。尽管这样，浆中脂类总含量也显著减少，大部分造成困难的化合物也完全被除去了。不论及制浆过程，原材料或化合物降解的化学性质，指出漆酶/介体系统在去除浆中脂类的有效性是必要的。尽管酶催化处理系统除去制浆中的脂类和木素有很大的潜能，但在工业理论变为现实之前仍有许多的问题 （比如通过基因工程和其它方法减少漆酶介体的使用，寻找一种安全、价格低廉有效的酶介体）需要我们去解决。

刘海棠编译自：Appl Microbiol Biotechnol(2006)vol.72 No.9:845–851

2010－4－10

论 著