浅谈漆酶-介体系统在染料降解中的应用研究＊

刘友勋，张 坤，宋相儒，陈莹莹，黄 娟

（新乡医学院基础医学院，河南 新乡 435003）

1 染料废水的现状

染料是指能在水溶液或在其他介质中，使纤维或其他基质染成各种鲜明而坚牢色泽的有机化合物。含染料废水对环境有很大影响，极低浓度的染料排入受纳水体就会造成强烈的视觉冲击和美学损害，结构稳定的染料在环境中有较长的滞留期，会对人类健康造成严重的危害。而中国染料工业、纺织、印染业发达，含染料废水排放量大、污染面广，每年有超过1.6×109t的废水未经任何处理而直接排入自然水体，给整个水生生态系统带来破坏性后果。目前，对染料废水的处理已成为中国废水治理的一个焦点，但高效、低成本的处理技术还较少，因此，研究和发展新型、低成本和高效的去除染料污染物技术对保护环境和人类健康具有重要意义。

2 染料废水不同处理方法

染料污染物去除的方法主要有物理法（吸附、膜技术等）、化学法（催化氧化法、电化学氧化法、臭氧氧化法等）及生物降解法（活性污泥、细菌、真菌及藻类等），这些传统去除技术各有特点和缺点。相对于物理、化学处理方法，生物处理方法具有成本低、不产生二次污染等特点，因此，利用环境生物技术降解环境污染物日益引起人们的关注，尤其是生物酶催化技术。在众多的生物酶中，对白腐菌产生的漆酶研究和应用最为广泛[1]。

3 漆酶处理染料废水的研究

漆酶是一种多铜离子蛋白，能催化多种酚类底物，以氧分子作为电子受体，产生的副产物只有水，对环境友好。由于漆酶的底物范围很宽广，能降解环境中多种有机污染物，在环境保护领域受到极大关注。真菌漆酶的氧化还原电位一般比较低（0.5～0.8 V），只能氧化降解氧化还原电势低的酚类结构底物，而不能氧化降解氧化还原电势高的非酚类底物。但研究发现在加入一些被称为漆酶介体的小分子化合物后，能够显著促进漆酶对非酚类底物的催化作用，还能大大提高对酚类底物的催化效率，从而进一步扩大漆酶底物的范围[2]。这些介体本身也是漆酶底物，起电子传递中间体的作用，使电子在酶和底物之间转移。

目前，合成及天然的介体有100多种，研究表明，合成介体的效率要高于天然介体，其中最常用的合成介体是2，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）和 1-羟基苯并三唑（HBT）等[3]。各种来源的漆酶都可以快速地将ABTS氧化成ABTS+中间体，进而氧化底物。正是由于介体的发现，使得漆酶和其介体构成的催化系统（LMS）具有强大催化能力，并进一步促进了漆酶的广泛使用，目前LMS在造纸工业、有机合成、生物传感器和环境处理等多个领域有广泛应用[4]。尽管以真菌漆酶为主的LMS系统有很强的催化能力和广阔的应用前景，但对于LMS的大规模应用还存在一些问题：①漆酶受到环境因子影响，如高温、强酸和强碱等可导致酶蛋白变性；②多数真菌漆酶的催化活性最适pH值在酸性范围，在中性或碱性条件下则活性低或没有活性；③可溶性小分子介体的二次污染和重复使用性；④由于漆酶分离和介体合成成本较高，直接导致LMS应用成本高而难以大规模应用。

采用一定载体以合适方式将酶固定化被认为是提高酶稳定性和解决酶重复使用的有效方法。酶固定方法有包埋法、结合法、吸附法及交联法，固定化酶方法的选择取决于载体性质、酶的种类、成本、使用目的和过程的复杂程度[5]。多数真菌漆酶的最适pH值在酸性范围且不耐高温，而挖掘新的漆酶资源是解决这一难题的有效途径。近年来发现芽孢外衣壳蛋白（CοtA）具有多铜离子氧化酶的活性，能氧化多数真菌漆酶的典型底物如ABTS、丁香醛连氮和愈创木酚等，被认为是一种细菌漆酶[6]。更重要的是，这种细菌漆酶催化活性最适pH在中性或碱性，甚至在高碱性pH也保留较高的活性，同时在宽广的pH范围（4～11）内都能保持较高的稳定性，这表明细菌漆酶不仅能用于真菌漆酶不适用的碱性环境，还具有一定的酸碱耐受性[6]。温度稳定性结果显示，CοtA在80℃高温能保持2 h的酶活性，证明CοtA也是一种热稳定蛋白，这可能因为CοtA是一种芽孢外衣壳蛋白[6]。与真菌漆酶类似，细菌漆酶对环境污染物染料有一定的降解作用。细菌漆酶在环境处理应用中具有两大优势：①细菌漆酶具有较强的热稳定性、酸碱耐受性，在中性或碱性有较好的活性；②细菌基因更易于克隆表达而有利于获得大量基因工程化的酶，从而降低酶使用成本。

许多学者认为，细菌漆酶有可能取代真菌漆酶而应用于各种领域[6]。但细菌漆酶的氧化能力较真菌漆酶低，如何提高细菌漆酶催化能力是其应用中需要解决的问题。借鉴真菌漆酶的介体作用，可在细菌漆酶的催化反应中加入介体来提高其催化能力，然而有关细菌LMS的应用研究报道还较少。漆酶的大部分催化反应是在溶液中完成的，如果大量使用可溶性合成介体，由于合成介体具有潜在的环境毒性，其使用后难以回收，废弃后会造成环境二次污染；如果催化反应完成后的介体能进行回收和重复使用，则这个问题迎刃而解。解决这一问题的一个思路是将介体小分子连接或吸附到固体材料中，使介体固定化，从而易于回收且能够重复使用。固定介体的方法主要采取吸附和共价连接两种方法，吸附方法虽然简单但易导致介体的渗漏；采用共价连接方法，虽然复杂但可避免介体的渗漏。

4 共固定化LMS降解染料的研究

虽然LMS在环保等领域应用前景好，但可溶性的酶和介体分子使用后不易回收重复利用，导致其成本高，难以大规模应用。少数学者已考虑到将酶和介体进行共固定化[7]，如采用自由基聚合等方式使漆酶和介体共固定在一起，但SUN等报道采用自由基聚合的共固定化LMS凝胶需要较长的时间才能完成对孔雀绿染料的脱色作用[7]，这表明与自由酶和介体分子组成的LMS相比，这种共固定方式的LMS存在催化效率低的问题。其中一个原因可能是酶和介体共固定化之后，LMS和底物之间存在较大传质阻力；另外一个原因是酶和介体被固定化后，彼此之间变成了刚性结构，导致介体不能像游离分子那样进出酶活性中心，同时由于分子结构的变化导致介体和酶分子的催化活性中心契合程度减弱，介体分子传递电子的能力也大大降低，进而导致LMS催化效率降低。如何解决这些问题？我们以前的研究显示，将介体（ABTS）共价修饰到氨基化SiO2纳米粒子上，可有效利用SiO2纳米和酶之间的良好生物相容性，同时在振荡状态下纳米级别的颗粒对反应的过程中的传质影响较小，可以大大改善固定化LMS催化效率[8]。根据前期的实验结果，可以猜想到用于固定化中连接介体的“接头分子”的结构类型和长度等会影响到介体分子与酶分子活性中心之间的作用，因此“接头分子”结构对固定化LMS催化效率的影响有必要深入研究。另外，酶固定化后刚性结构也可能会影响酶和介体的结合，可以通过采用不同的酶固定化方式，尽量减少其不利影响。

5 结束语

漆酶是一种多铜离子蛋白，能催化多种酚类底物，以氧分子作为电子受体，产生的副产物只有水，对环境友好，在染料等污染物降解上有很大的应用前景。由漆酶组成漆酶-介体系统，可以有效解决因漆酶氧化还原电势低造成的难题，加速对污染物的降解。虽然LMS在环保等领域应用前景广泛，但可溶性的酶和介体分子使用后不易回收重复利用，导致其成本高，难以大规模应用。漆酶和介体进行共固定化是解决这个难题的重要途径，但如何使二者有效地共固定还需要进一步研究。