牙鲆淋巴囊肿病自愈过程中细胞因子的表达研究*

邢明青,孙修勤,郑风荣,郑明刚,洪旭光,曲凌云,吴谡琦

(1.中国海洋大学生命学院,山东青岛266003;2.国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061)

牙鲆淋巴囊肿病自愈过程中细胞因子的表达研究*

邢明青1,孙修勤2**,郑风荣2,郑明刚2,洪旭光2,曲凌云2,吴谡琦2

(1.中国海洋大学生命学院,山东青岛266003;2.国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛266061)

中国北方养殖牙鲆的淋巴囊肿病一般发生在水温较低的10～12月,之后随水温的升高肿瘤脱落、出现自愈现象。搞清自愈机理,是有效抑制和减少淋巴囊肿病的重要科学内容。本文研究了不同饲育水温下健康和患淋巴囊肿病牙鲆细胞因子的表达变化,初步探讨了细胞因子在肿瘤自愈中的作用。通过模拟养殖中的水温变化,采用荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)技术,检测了14,18,22和26℃下牙鲆肝、脾、头肾组织中6种细胞因子(白细胞介素1β(IL-1β)、Mx蛋白(M x)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、趋化因子(IL-8)和趋化因子受体(IL-8R))表达变化。结果表明,患病牙鲆肝、脾、头肾组织中的IL-8、IL-8R、Mx、IL-1β、TNF和TNFR-1表达量随温度升高而显著升高;健康牙鲆上述细胞因子的表达基本未出现随温度升高而显著上升的现象。本试验结果响应了养殖水温升高肿瘤脱落的现象,提示上述细胞因子在淋巴囊肿病自愈过程中可能发挥了抗病毒作用。

淋巴囊肿病;细胞因子;温度;自愈

淋巴囊肿病(Lymphocystis disease,LCD),是淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)引起的一种鱼类传染病,是我国海水养殖鱼中首例流行的病毒性疾病。该病在养殖水温升高后,肿瘤往往会脱落,也就是存在着自愈现象。肿瘤自愈有一定的机制,搞清其机制对有效减少该病毒病的发生有重要的意义。

鱼类和哺乳动物一样,其免疫系统可分为特异性免疫和非特异性免疫2种[1-2],细胞因子(Cytokine)是其中的重要组成部分。已知鱼类体内的多种细胞因子具有促炎作用,如IL-1、TNF和趋化因子等具有增强单核/巨噬细胞的吞噬能力和N K细胞杀伤力的作用,这些细胞因子还可以促进B细胞的增殖分化与成熟、产生抗体及诱导T细胞分化。抗病毒类细胞因子如干扰素诱导蛋白M x,可使机体抵抗病毒复制、促进病毒的清除[3-5]。因此,以细胞因子为对象、了解其表达变化,有助于解析肿瘤自愈与免疫水平的关系。

本论文模拟养殖条件,设立14,18,22和26℃4个饲育水温,采用real-time PCR技术检测患病牙鲆与健康牙鲆主要免疫器官肝、脾和头肾中IL-8、IL-8R、M x、IL-1、TNF和TNFR 6种细胞因子的表达,以期探讨淋巴囊肿病自愈与鱼体内细胞因子表达的关系。

1 材料

1.1 试剂与仪器

M S-222(鱼安定,批号040608)为杭州动物药品厂产品,dN TP、RNAase、RnaseH、M -MLV Reverse Transcrip tase、Taq DNA聚合酶和ProteinaseK均为Premega公司产品,琼脂糖(Agarose)为B IOWEST公司产品,Trizol(Invitrogen公司),饱和酚、氯仿和异戊醇为上海生物工程公司产品,SYBR Prem ix Ex Taq Kit(Takara公司);DL-2000 marker(北京鼎国生物技术有限公司)。

PCR仪(Biometro),低温离心机(Eppendorff),荧光定量PCR仪(Eppendo rff),紫外分光光度计(GE Healthcare安玛西亚)。

2 方法

2.1 实验动物及处理

实验用鱼为乳山市养鱼场同一批次的牙鲆,体长15～20 cm,体质量60～80 g。运回实验室后,首先用PCR方法对目测健康牙鲆(体表光滑,未见囊肿)进行LCDV检测,确认无LCDV后,作为对照组牙鲆。对体表有囊肿的牙鲆也使用PCR方法加以确认是否携带LCDV,如果检测结果为阳性,即作为试验组。试验组和对照组牙鲆的饲育水温设置为14,18,22和26℃(±0.5℃),8个水槽中各饲育5尾牙鲆;充气、每日更换1/2海水并喂食1次;水温调节以每2 d升高1℃,到达试验温度后稳定7 d,将牙鲆放入含麻醉剂M S-222(浓度为1.2 g/L)的海水中,待体色稍变黑时(1～2 min)立即取出,迅速解剖,取肝、脾和头肾,放入液氮中保存,用于细胞因子表达实验。

2.2 LCDV检测

从目测健康及携带囊肿的牙鲆尾静脉取血0.5 mL,3 000 g/min离心10 min,取沉淀,弃上清,液氮研磨,转入灭菌离心管中,加入1 mL的DNA裂解液、5μL蛋白酶K(20μg/μL)、2μL RNA酶(10μg/μL),37℃孵育过夜,加等体积的饱和酚抽提2次,充分混匀,15 000 g/m in,离心10 min;取上清液,酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1次,充分混匀,15 000 g/min,离心10 m in;取上清,加1/10体积的3 mmo l/L醋酸钠,2倍体积的无水乙醇,充分混匀,沉淀DNA。用牙签挑取絮状沉淀,70%的乙醇洗涤3次,溶于20μL无菌水中。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.3 PCR引物设计与扩增

利用本实验室以前研究中参照LCDV主要衣壳蛋白MCP0147L开放读码框的保守区序列所设计的引物[6],上游引物为5’-GACGAA TTCA TGA TCGGTAA TAC-3’;下游引物为5’-GACGCGGCCGCGAA TAA TA TTCACT-3’,扩增片断为622 bp。取上述已提取的目测健康和携带囊肿的牙鲆全血DNA各2μL作为模板进行PCR扩增,反应体系为25μL,反应条件为:94℃、变性4 min;94℃、45 s,50℃、45 s,72℃、1 min,扩增30个循环;72℃延伸10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察。

表1 PCR扩增的反应体系Table 1 PCR amplification reaction volume

2.4 肝、脾和头肾组织中RNA提取及cDNA的反转录

2.4.1 RNA提取 取肝、脾和头肾组织80～100 mg,研钵中加液氮研磨,至粉状时转移到预先称质量、DEPC水处理过的5 mL塑料离心管中。加入1.0 mL Trizol,室温下放置5 min;加入0.2 mL氯仿,盖紧,用手震荡混匀15 s;室温下放置5 min,4℃、16 000 r/min离心15 min,取上清液移至另一新的离心管中,管子处理同上;加异丙醇0.5 m L,混匀,室温下放置10 min,4℃,16 000 r/min离心10 min;弃上清,加1.0 mL的75%乙醇(DEPC处理灭菌纯水配制)混匀,4℃,12 000 r/min离心10 min,弃上清;室温下干燥,悬浮于DEPC处理的20μL灭菌纯水中溶解,加入RNase抑制剂并分装成4管,分别用于测定浓度、RNA完整性、real-time PCR和-80℃保存。

2.4.2 cDNA的反转录 根据提取的总RNA浓度,0.2 m L微量离心管中分别加入:10μmol/LOligod T-adap tor(5’-GAC TCG AGT CGA CGA A TT CAA-3’)1μL和适量RNase free水(总体积16μL);轻轻混匀、离心,70℃加热5 min;立即将微量离心管插入冰浴中、至少1 min,然后加入下列试剂的混合物:5×Buffer 5μL、10 mmol/L dN TPmix 3μL、M -MLV反转录酶1μL;轻轻混匀、离心,42℃水浴孵育1 h、94℃加热5 m in、终止反应;加入1μL RNaseH(60 U/μL)、37℃孵育20 min,以降解残留的RNA。同一实验组的每例样品分别取5μL混合到一起,以混合物作为1个试验组的供试样品。

2.5 Real-time PCR反应

2.5.1 细胞因子引物 引物由上海生工公司合成,产物长度在90～150 bp之间,内参为β-actin(见表2)。

表2 细胞因子引物Table 2 Cytokine primers used in this study

2.5.2 Real-time PCR的反应条件 Real-time PCR的反应体系:参照试剂说明书,调整模板浓度,确定最优化的反应体系参见表3。

表3 Real-time PCR的反应体系Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction volume

整个加样程序均在冰盒上避光操作。

Real-time PCR的反应程序:94℃变性2 min,1个循环,94℃变性10 s,60℃退火10 s,72℃延伸10 s,40个循环;反应结束后20 min缓慢升温做融解曲线。

反应用8联排PCR管(BB I)和光学级透明管盖(ABgene),每个cDNA样品重复3次,同时设阴性对照;PCR反应时,每个循环扫描记录一次荧光信号。荧光信号大于Baseline 10倍以上的,作为阳性信号使用。

2.6 数据处理

设18℃时的健康对照组为标准对照组,所得数据采用2-ΔΔCT法处理,利用SPSS10.0软件,对同一温度下实验组和对照组的基因表达水平进行单因素方差分析,以P<0.05为显著性差异。

4.1.2 创新教学模式构建特色人文教育体系。构建贯穿于医学教育始终的、科学的医学人文教育体系，增加与职业培养相关的实践活动，提高医学生的职业适应能力，增加人文选修课程，提升医学生的人文素养。

3 结果

3.1 LCDV的PCR检测结果

对照组牙鲆血液中LCDV衣壳蛋白MCP0147L的PCR扩增产物进行电泳后,未检出0.6 kb目的条带。体表携带肿瘤的牙鲆血液中在大约0.6 kb的位置可检测出目的条带。

图1 LCDV衣壳蛋白MCP0147L的PCR扩增产物电泳结果Fig.1 The fragments of LCDV envelope protein were detected from control Japanese flounders

图2 LCDV衣壳蛋白MCP0147L的PCR扩增产物电泳结果Fig.2 The fragments of LCDV envelope protein were detected from experimental group

图3 不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中IL-1β的表达Fig.3 The determination of the IL-1βexp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2 细胞因子表达的统计结果

3.2.1 不同温度下肝、脾和头肾中IL-1β的表达 图3(图表横轴表示温度,纵轴表示细胞因子表达量比值)是不同温度下IL-1β在牙鲆肝、脾、头肾中的表达,可见试验组牙鲆肝脏(图3a)中IL-1β的表达在22℃时达到峰值、为标准对照的3.8倍,差异显著(P<0.05);脾和头肾中(图3b、c)IL-1β的表达在26℃时达到峰值,分别为标准对照的10.8倍和13.9倍(P<0.01)。对照组牙鲆肝、脾中IL-1β的表达量22℃时达到峰值,分别为标准对照的1.9倍和5.4倍(P<0.05),而头肾中的IL-1β表达量无显著性差异(P>0.05)。

3.2.2 不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中Mx的表达 图4(图表横轴表示温度,纵轴表示细胞因子表达量比值)是不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中M x的表达:可见试验组牙鲆肝和脾脏(图4a,b)中的M x表达在26℃时达到峰值,为标准对照组的31.1倍和26.5倍(P<0.01);头肾(图4c)中22℃时达到峰值,为标准对照组的42.1倍(P<0.01)。对照组牙鲆肝、脾、头肾中M x的表达随温度升高稍有增加,增加最大为头肾(图4c)在26℃时达到标准对照组的2.1倍(P<0.05)。

图4 不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中M x的表达Fig.4 The determination of the Mx expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.3 不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中TNF的表达

图5(图的横轴表示温度,纵轴表示细胞因子表达量比值)是不同温度下牙鲆TNF在肝、脾、头肾中的表达变化,可见试验组22℃时肝、脾脏内(图5a,b)TNF的表达达到高峰,分别为标准对照的8.51和5.7倍;26℃时头肾(图5c)中的表达量为标准对照的5.7倍(P<0.05)。对照组肝脏(图5a)的TNF表达量在26℃时比标准对照下降了2.8倍(P<0.05);而脾和头肾(图5b,c)中的表达量随温度升高而增加(P<0.05)。

图5 不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中TNF的表达Fig.5 The determination of the TNF exp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.4 不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中TNFR的表达

图6(图表横轴表示温度,纵轴表示细胞因子表达量比值)是不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中TNFR的表达情况,可见在22℃时试验组牙鲆肝、脾脏和头肾(图6a,b,c)中的TNFR表达达到峰值,分别为标准对照的22.1倍、4.87倍和21.55倍(P<0.01)。对照组肝、头肾(见图6a,c)中TNFR的表达量在26℃达到峰值,比标准对照分别增加了5.48和5.6倍(P<0.05)。

图6 不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中TNFR的表达Fig.6 The determination of the TNFR exp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

图7 不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中IL-8的表达Fig.7 The determination of the IL-8 expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.6 不同温度下牙鲆肝、脾、头肾中IL-8R的表达

图8(图表横轴表示温度,纵轴表示细胞因子表达量比值)是IL-8R在牙鲆肝、脾、头肾中不同温度下的表达,可见试验组脾脏和头肾中IL-8R的表达(图8b,c)在26℃达峰值,分别为标准对照的4.5和5.6倍,(P<0.05);肝脏中的IL-8R表达量(图8a)在22℃时达峰值,为标准对照组的9.73倍(P<0.01);对照组肝、脾中的表达(图8a,b)在22℃时达峰值,为标准对照的2.5和4.1倍(P<0.05),头肾(图8c)中在26℃达峰值,为标准对照的2.6倍(P<0.05)。肝脏(图8a)在14℃时无论试验组还是对照组表达量均极低,分别为标准对照的0.06和0.04倍(P<0.05)。

图8不同温度下牙鲆肝脏(a)、脾脏(b)和头肾(c)中IL-8R的表达Fig.8 The determination of the IL-8R expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

4 讨论

在硬骨鱼的防御机制中,温度是一个重要因素,它往往会影响所有代谢过程[7-8],但关于温度对鱼类抵抗病毒感染的研究报道为数极少。根据本实验室对淋巴囊肿病长达10 a的调查研究,注意到牙鲆出现LCDV肿瘤的季节多在10～12月,此时养殖水温在17℃左右,水温达到25℃左右时,肿瘤开始脱落。

M x蛋白,是一种由干扰素诱导的抗病毒分子,在牙鲆细胞系内可以抑制H IRRV和V HSV(Viral haemorrhagic septicemia virus)的复制[9]。Jong-Young Lee等[10]克隆了牙鲆的MxcDNA,证实其在脾、肾、肠和脑中的表达量最高,其次为肝脏和肌肉。本研究发现,试验组中肝、脾和肾中的M x表达均随温度的升高明显增加,26℃时与标准对照相比,增加到31.1和26.5倍(P<0.05);只有肾脏中在22℃达就达到峰值,为42.1;虽然26℃时有所下降,但也超过标准对照35.2倍。在对照组,随温度升高,M x的表达,虽有增加(肾脏26℃)但最高只有标准对照组的2.1倍(P<0.05)。该结果提示,高温可增加M x的表达,但携带病毒的试验组表达量增高更多,这有利于提高机体对病毒的抵抗。

IL-1是一种早期炎性细胞因子,细菌、活病毒均可诱导IL-1的产生。Zou等[11]利用脂多糖(LPS)诱导虹鳟鱼白细胞中IL-1β的基因表达研究中发现,孵育温度是影响其表达量的一个重要因素,使用同样剂量的LPS刺激后22℃下白细胞中IL-1β基因的转录水平较4℃时增加了8倍,由此认为温度升高促进了该基因的表达。实验表明,在肝脏中,试验组IL-1的表达随温度的升高而增加,22℃达到峰值,是标准对照组的3.8倍,(P<0.05),26℃表达量又降了下来,是标准对照组的1.7倍;在脾、头肾中,IL-1的表达随温度的升高而升高,在26℃达到峰值分别为10.8,13.9倍(P<0.05)。在对照组也呈现出这种趋势,只是表达升高的倍数不如试验组。说明高温下,可促使牙鲆IL-1的表达增加,对病毒的感染所产生的免疫激活应答增强。

Laing KJ[12]的研究表明,体外用V HSV感染虹鳟白细胞后,CXC的m RNA表达量增加;肌肉注射V HSV,在体内得出了同样的结果,说明病毒可诱导CXC型趋化因子的表达。本实验结果表明,高温下试验组肝脏的IL-8表达与标准对照有极显著的差异;对照组中,肝脏IL-8随温度升高无明显变化,脾和头肾中的IL-8基因随温度升高与标准对照组有显著性差异,这说明在LCDV感染牙鲆的肝脏中IL-8基因是对温度较敏感的一个指标。本文在试验组和对照组中,得到了白介素受体IL-8R随温度升高而表达量上升的结果,虽然还不能确定IL-8R与IL-8表达量之间的关系,但可以明确的是:两者表达量的增加有利于机体发挥抗感染作用。

已知肿瘤坏死因子TNFα基因存在组成型和诱导型2种表达调控机制,在抵御病原感染过程中发挥重要作用。Hirono I[13]等用EST法从牙鲆中找到了TNF基因,且指出牙鲆TNF类似于哺乳动物的TNFα,经LPS刺激后可在不同组织内检测到表达上调。邱丽华[14]等利用RT-PCR技术,发现TNFα基因在未受刺激鱼的头肾和脾脏中也明显表达。脂多糖(LPS)和虹彩病毒(Iridovirus)可诱导TNFα基因的高水平表达,LPS刺激后表达较强的组织是头肾和脾脏,而病毒感染后肝脏中的TNFα表达较强。研究发现[15-16],TNF可促使IL-1和CXC等细胞因子的分泌、增强免疫调节水平、靶细胞的杀伤、介导细胞凋亡和抗感染能力。Chan-Il[17]等研究发现,健康牙鲆的TN-FR1在肝、脾、肾中表达较高。本文实验组牙鲆的肝、头肾中TNF和TNFR表达量随温度升高极显著增加,是否TNF与哺乳动物同源物具有相似的肿瘤杀伤功能,尚需要进一步研究。

本实验检测了IL-8、IL-8R、M x、IL-1、TNF和TNFR 6种细胞因子在不同温度下的表达变化,本文设定的温度点是养殖实践中所包含的,在这一温度范围内,作者发现试验组的这6种细胞因子虽然表达量出现峰值的温度不同,但都具有随温度升高而表达量增加的趋势,说明温度可促进患病牙鲆细胞因子基因的表达,也提示温度可增强牙鲆的免疫应答水平,为淋巴囊肿病的自愈机理提供了科学依据。

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Investigation of Relationship Betw een Cytokines Exp ression and Lymphocystis Disease(LCD)Self-Healing in Japanese Flounder(Paralichthys olivaceus)

XING M ing-Qing1,SUN Xiu-Qin2,ZHENG Feng-Rong2,ZHENGM ing-Gang2,HONG Xu-Guang2,QU Ling-Yun2,WU Su-Qi2
(1.Collegeof Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.The First Instituteof Oceanography,SOA,Qingdao 266061,China)

We found that lymphocystis disease(LCD)of infected Japanese flounders cultured in northern China were healed by them selves with hyper the rmia;thismechanism was rarely reported.To investigate the relationship between the self-healing phenomenon and hyperthermia,we determined the expression of six cytokines(IL-1β,IL-8,IL-8R,M x,TNF and TNFR-1)in major immune organs(liver,sp leen,and head kidney)of healthy and sick Japanese flounders at various temperatures(14,18,22 and 26℃)using real-time fluorescence quantitative PCR.Results showed that the cytokines expression quantity from the infected Japanese flounders had positive relation with temperature,suggesting the inducing capability of hyper thermia.It was indicated that the self-healing of the LCD was related with the enhancing activities of cytokines.

lymphocystis disease;cytokine;temperature;self-healing

S941

A

1672-5174(2010)12-043-08

国家高技术研究发展计划项目(2006AA 100309)资助

2010-05-03;

2010-06-10

邢明青(1970-),女,博士生,研究方向:分子生物学。

**通讯作者:E-mail:xiuqin_sun@fio.org.cn

责任编辑 于 卫