实时定量PCR检测拟南芥和盐芥谷胱甘肽过氧化物酶表达水平

赵宝添 孙娜娜 马志媛 谭伟杰

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是1957年由MillsRandle在牛红细胞中发现的。与动物相比,植物中GPX研究起步较晚,1985年Drotar等报道在组织培养的菠菜、玉米、美国梧桐及水生藻类中检测到该酶活性[1]。植物体中谷胱甘肽过氧化物酶的结构和功能:植物GPX为非组成型表达,但可受胁迫诱导。研究表明,表达GPXmRNA稳态水平在不同环境胁迫下会有所上升,如病原体、高浓度的盐、重金属机械刺激或铅毒等[2]。因此,GPX在植物氧化信号转导过程中可能起重要作用。有报道指出,模式植物拟南芥GPX可能是潜在的解毒剂,可直接利用GSH为还原剂[3]。拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶家族有7个成员,分别专一定位于胞液、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和质外体等亚细胞器中(Milla,2002)。这些酶普遍存在且在非生物胁迫下受各种信号通路调节,但目前这些酶在植物体中的功能并不完全清楚。利用模式植物拟南芥的多种突变体来研究GPX的功能,表明ATGPX具有双重功能:首先可控制H2O2的稳态[4];其次,转导保卫细胞中H2O2信号,介导细胞应答脱落酸和干旱胁迫的气孔调节[5]。

1材料与方法

1.1试验材料

小盐芥、拟南芥。

1.2试验方法

提取盐芥、拟南芥总RNA,RT-PCR为CDNA。实时定量PCR检测。

盐芥GPX:5′引物TCGTCCTCTTCCTTTATCGACA ACG;3′引物CGCATCCTTCACGGTGAAATCATAG。

拟南芥GPX:5′引物TCTCTTCCAATTTCTACAACG GGA GC;3′引物CTTAGCATCCTTGACGGTGAAATCG。

反应条件:94℃ 3min(94℃ 40sec;56℃ 30sec;72℃ 1min)30个循环,72℃ 7min。

2结果与分析

由表1可知,拟南芥盐激处理及对照:以肌动蛋白为内参,2-△△CT值为2.776 626 901>1,表明拟南芥盐激处理后,谷胱甘肽过氧化物酶表达有所上调且上调较多;盐芥盐激处理及对照:以肌动蛋白为内参,2-△△CT值为0.915 945 29<1,表明盐芥盐激处理后谷胱甘肽过氧化物酶表达有所下调。

3讨论

本试验把未经盐激处理的样品作为参照因子,经内标基因均一化处理后,通过2-ΔΔCT方法计算。根据定义,对于未经处理的参照样,△△CT=0,而20=1,即未经处理样本的倍数变化为1,而对于那些经过处理的样本,相对于参照因子基因表达的倍数为2-△△CT。出现这种结果有几种可能:一是盐处理的浓度过高,植物体内产生的活性氧超出了抗氧化系统的清除能力,对植物造成伤害,从而使植物的基因组转录受到影响;二是植物为了防御盐胁迫,适应性地降低了植物基因组的转录,从而更有效地利用体内资源;三是在盐胁迫下谷胱甘肽过氧化物酶通过活性的升高对清除活性氧起到积极作用,通过表达谷胱甘肽过氧化物酶的方式提高耐盐性;四是此次试验仅仅检测了谷胱甘肽过氧化物酶同工酶中的1种,并不能代表全部的谷胱甘肽过氧化物酶情况,植物对盐胁迫的耐受机制可能很复杂,还需要进一步试验。

4参考文献

[1] 沈成国.植物衰老生理与分子生物学[M].北京:中国农业出版社,2001:57-58.

[2] 李晓燕,宋占午,董志贤.植物盐迫生理[J].西北师范大学学报,2004(3):106.

[3] 徐文东,杨强,徐志伟.谷胱甘肽及其相关酶在生物体内的作用[J].福建热作科技,1999(24):42.

[4] YUCHEN MIAO,DONG L V,PENGCHENG WANG.An Arabidopsis Glutathione Peroxidase Functions as Both a Redox Transducer and a Scavenger in Abscisic Acid and Drought Stress Responses[J].The Plant Cell,2006(18):2749-2766.

[5] 戚元成,张世敏,王丽萍,等.谷胱甘肽转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长[J].植物生理与分子生物学学报,2004(30):517-522.