脑肿瘤干细胞的研究进展

韩　昆　万德红　丁　弘

[摘要]人脑胶质瘤是一种常见的颅内恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的35%-60%(平均约44%)。虽然人类手术水平和手术技巧有了很大提高,但仍然很难攻克这一顽症。病人经过手术切除、放疗、化疗后,身体创伤很大,胶质瘤却几乎无一例外的复发。这与胶质瘤浸润性生长和远处转移的特性密切相关。最近研究发现脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell,BTSC) 是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源,在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。培养鉴定脑胶质瘤干细胞,对研究胶质瘤的发病机理、转移机制和复发原因有着不可替代的作用。

[关键词]肿瘤干细胞;胶质瘤

[中图分类号]R739.41 [文献标识码] A [文章编号]1004-8650(2009)10-142-04

据我国城市居民中调查,颅内肿瘤患病率为32/10万,一项世界性的统计为40/10万,脑胶质细胞瘤(简称胶质瘤)是颅内肿瘤中最多的一类,接近颅内肿瘤的半数。其中恶性程度较高的胶质瘤和髓母细胞瘤以其浸润性生长的特性,手术切除效果不佳,复发率较高,预后较差。最近研究人员从脑肿瘤标本中成功分离出一种在无血清培养基中呈悬浮生长的细胞,体外培养发现这种细胞具有自我更新和繁殖能力,具有多向分化潜能,并且表达神经干细胞特异性的标记物。将其与干细胞比较后,提出了肿瘤干细胞的概念。本文将对脑肿瘤干细胞的研究现状做一综述[1,2]。

1 脑肿瘤干细胞的提出

1.1 肿瘤干细胞的提出

Reya等比较干细胞和肿瘤细胞时发现二者具有相似性的生物学特征,于2001年提出肿瘤干细胞(cancers stem cell,CSCs)学说。并推测CSCs具有正常干细胞一样的自我更新和增殖、分化能力,其来源可能是具有长期存活能力、通过基因突变和后生性变化积累逐渐向恶性化进展的正常干细胞。

1.2 肿瘤干细胞的发现

Wulf GG等人研究表明,白血病中存在有为数不多的细胞具有无限增殖、自我更新、多向分化等类似干细胞的特征。而其他细胞只有有限的增殖或无增殖能力,因而失去产生新肿瘤的能力。肿瘤研究者称上述类似于干细胞的肿瘤细胞称肿瘤干细胞。随后陆续有文献报道从人类急性粒细胞白血病、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤以及中枢神经系统肿瘤中分离得到具有干细胞特性的一类细胞,并且使其在实验动物身上实现肿瘤再现。

1.3 脑肿瘤干细胞

Hemmati等对小儿髓母细胞瘤和胶质瘤进行研究,发现存在与NSC性质相似的细胞,它们可能参与了脑肿瘤形成[3]。这些细胞在体外可形成神经球,能够自我更新,且具有多向分化潜能,在一定环境中可分化成神经元和胶质细胞,细胞比例与原肿瘤相似。不同的是,这些细胞表现出异常的增殖能力。Singh等和Yuan等发现脑肿瘤中几乎所有的细胞增殖均由一小部分表达人类干细胞标志物CD133+的细胞产生,即脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell,BTSC)[4,5]。在随后脑肿瘤研究中,多位学者从恶性胶质瘤中分离、培养并纯化出一些有干细胞特性的细胞,并据此提出脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell,BTSC)学说。

1.4 肿瘤干细胞学说

肿瘤干细胞学说认为所有的肿瘤组织并不是由均一的肿瘤细胞所组成的,在众多的肿瘤组织中,不同的细胞具有不同的增殖、浸润和转移能力,亦即肿瘤的异质性。在一些肿瘤组织中存在为数不多的但担当着干细胞角色的肿瘤细胞,这些特殊的肿瘤细胞具有干细胞的一切基本特性,包括自我更新能力、无限增殖能力和多向分化潜能,于是定义为肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)[6]。

2 脑肿瘤干细胞的生物学特性[7-13]

2.1 悬浮性生长

脑肿瘤干细胞在无血清培养基(加入bFGF、EGF等生长因子)中呈悬浮状生长,并保持肿瘤细胞的未分化状态。Singh等从14例儿童脑肿瘤(包括髓母细胞瘤、星型胶质细胞瘤及室管膜瘤等)中培养出呈悬浮状生长的细胞球;Kondo等报道在包括C6胶质瘤细胞系的6个肿瘤细胞系中有4个培养出肿瘤球。

2.2 表达干细胞标记物

CD133是相对分子量为120kD的跨膜蛋白,最初作为造血干细胞标记物被人们认识,现在也是公认的神经干细胞标记物。同时,从胶质瘤或细胞系中培养出的具有无限增殖、自我更新、多向分化特性的悬浮细胞也呈阳性表达。神经巢蛋白(Nestin)是一种在神经干细胞和前体细胞中表达的骨架蛋白,研究表明上述细胞也表达Nestin。

2.3 自我增殖和更新能力

Toru Kondo等研究发现在C6细胞系中培养出的(side population,SP)SP细胞在PDGF 加 bFGF的培养条件下能自我更新和增殖产生新的SP细胞;Singh等将原代培养的肿瘤球稀释后继续培养,结果不同病理类型的肿瘤球都生成了与原来相同表型的肿瘤球,同时发现肿瘤干细胞的自我更新能力远高于作为对照的神经干细胞,且不同类型的肿瘤干细胞的自我更新能力不同。

2.4 多向分化潜能

还是Toru Kondo等证明SP细胞能分化生成SP细胞和非SP细胞,而非SP细胞却只能生成非SP细胞;同时有文献证明,本不表达分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物的悬浮细胞球在培养基中加入血清后既贴壁生长,并形成单细胞层,同时表达分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物如微管相关蛋白2(MAP2)、β-tubilin 3、脱质纤维酸性蛋白(GFAP)、血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)等。

3 脑肿瘤干细胞与神经干细胞

3.1 相同点

脑肿瘤干细胞与神经干细胞的培养条件相同,目前BTSC采用与神经干细胞(neural stem cell, NSC)相同的无血清培养方式,需要相同的生长因子维持;相同的生长方式,BTSC和NSC在无血清培养基中均呈悬浮状生长;相同的表面标记物,BTSC表达NSC的表面标志,如CD133和Nestin;相同的分裂生长方式,BTSC和NSC均按照对称和不对称两种分裂方式发育生长,究竟采用哪种分裂方式与干细胞所处环境相关[14]。

3.2 不同点

自我更新和增殖能力不同,Singh等发现在稀释为每孔l00个细胞时,髓母细胞瘤平均形成20.27个肿瘤球,纤维型星形细胞瘤为5.85个,作为对照的正常神经干细胞仅2.88个,这表明肿瘤干细胞自我更新能力强于神经干细胞;Galli等报道从多型胶质母细胞瘤中培养出肿瘤球,并且可连续传代80次以上(180-280天),在传代的后期更易出现悬浮球状生长且增殖速度加快,而在同样的条件下神经干细胞不能维持1个月[15,16]。

4 脑肿瘤生成细胞的来源

关于脑肿瘤生成细胞的来源,目前主要集中于三个观点:一是来源于胶质细胞,这是早在上世纪20年代由Bailey和Cushing提出的观点,认为星形胶质细胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生的关键所在。在神经干细胞发现之前,这一学说在胶质瘤的起源问题上占据着不可动摇的地位;二是来源于神经干细胞,胶质瘤往往不是由单一的恶变胶质细胞组成,而是多种细胞成分并存,如:神经节细胞、少突星形细胞等等。神经干细胞具有多种分化潜能和两种分裂方式,对称式分裂和不对称式分裂,当进行不对称分裂时,神经干细胞分裂为一个新干细胞和一个神经祖细胞,神经干细胞发生致瘤性分子事件时,神经祖细胞携带癌基因表达产物继续增殖并导致肿瘤发生,新干细胞则继续分裂提供源源不断的前体细胞[17]。Lubensky等以放射诱导方法证实神经干细胞或神经祖细胞的放射损害将抑制细胞的正常分化并导致肿瘤形成。三是来源于肿瘤干细胞,尚未得到证实,原因在于肿瘤干细胞的来源没有得到验证,当前研究多支持肿瘤干细胞来源于神经干细胞,理由在于上述的多种相似点[18]。

5 存在的问题

5.1 肿瘤干细胞的来源

如上所述,肿瘤干细胞是否来源于神经干细胞是当前研究的热点。神经干细胞较成熟胶质细胞更容易转化形成肿瘤干细胞的可能原因包括:①神经干细胞是未分化的幼稚细胞,在转化过程中较成熟细胞可以减少一个脱分化的过程,也就是说,相比较于成熟细胞,神经干细胞只需要更少的突变就可以转化为肿瘤干细胞。②神经干细胞有更长的生命周期,因而更容易累积各种致癌性突变的变异发生转化。

5.2 肿瘤干细胞在肿瘤中所占比例与肿瘤恶性程度之间的关系

Kondo报道了C6胶质瘤细胞系中为0.4%,Singh报道毛细胞星形细胞瘤中为0.3%,髓母细胞瘤中为25%,Galli等报道髓母细胞瘤中为1%-6%,多形胶质母细胞瘤中为9%-19%[19,20]。以上数据似乎表明肿瘤恶性程度越高,肿瘤干细胞的比例也就越大。

5.3 不同特性的肿瘤干细胞与肿瘤恶性程度之间的关系

肿瘤干细胞自我更新、增殖、分化和迁移能力的大小在临床的体现就是肿瘤的生长及播散转移速度的快慢和侵袭能力的强弱。即肿瘤的肿瘤干细胞决定了其临床恶性程度的高低。若肿瘤干细胞的上述特性强,则在临床表现为肿瘤生长迅速,容易侵犯周围组织并播散转移,肿瘤的恶性程度高。反之则表现为肿瘤生长缓慢,不易侵犯周围组织及播散转移,肿瘤的恶性程度低。

5.4 肿瘤干细胞与机体免疫系统

远处转移是恶性肿瘤的特点,肿瘤干细胞在血液中转移的过程中是如何躲过机体免疫系统的监视和攻击的?

5.5 肿瘤干细胞的鉴定缺乏统一的标准,有待进一步完善统一的鉴定标准:当前肿瘤干细胞的分离培养都是以神经干细胞为参照物的,包括肿瘤干细胞的鉴定也是以神经干细胞的标记物为主。CD133是相对分子量为120kD的跨膜蛋白,最初作为造血干细胞标记物被人们认识,现在也是公认的神经干细胞标记物。同时,从胶质瘤或细胞系中培养出的具有无限增殖、自我更新,多向分化的特性的悬浮细胞也呈阳性表达。神经巢蛋白(Nestin)是一种在神经干细胞和前体细胞中表达的骨架蛋白,研究表明,上述细胞也表达Nestin。当前肿瘤干细胞的鉴定以Nestin和CD133为主,但研究发现,同一群肿瘤细胞中Nestin阳性的比例高于CD133阳性的比例。这说明神经干细胞的标记物与肿瘤干细胞并不完全相同。如何证明在神经干细胞培养条件下生长的悬浮细胞球就是肿瘤干细胞,体内致瘤性实验是必不可少的一步。只有在动物体内生长出与原发肿瘤同种性质的肿瘤才具有更强的说服力。寻找肿瘤干细胞特异性的标记物将是下一步研究的重点。

6 脑胶质瘤干细胞学说的意义

肿瘤干细胞假说为肿瘤的研究提供了新的思路和方向。BTSC的确凿鉴定是对脑肿瘤干细胞假说的最有力支持。

6.1 从肿瘤发生角度

肿瘤的发生是多因素、多环节共同作用的复杂过程,至今尚未在千头万绪中找到确切的致瘤因素。如果肿瘤干细胞学说得到确认,将在肿瘤的发病原因上迈出坚实的一步,把注意力从寻找肿瘤致病因素转移到肿瘤干细胞的来源上来。

6.2 从肿瘤的发展角度

恶性肿瘤的特点之一是生长失控,实验证明,并不是所有的肿瘤细胞都具有自我繁殖的能力,永生性增殖是干细胞所特有的,正是由于干细胞不断的分裂、转化,肿瘤才不断的生长。

6.3 从肿瘤的转移角度

肿瘤干细胞从肿瘤发源地脱落,播散到新的位置后,如局部微环境适合,即增殖分化形成新的肿瘤。

6.4 从肿瘤的治疗角度

当前肿瘤的治疗以手术加放疗、化疗为主,但多数容易复发,原因在于没有彻底消灭肿瘤干细胞。手术只能切除一定范围的肿瘤,对浸润性生长和远处转移的肿瘤干细胞没有得到清除,放、化疗主要针对于普通肿瘤细胞,对肿瘤干细胞的敏感性较差,另外存在于肿瘤干细胞体内的ABC复合体能将化疗药物泵出体外。

6.5 从肿瘤的复发角度

要想从根本上遏制肿瘤的复发,彻底的消灭肿瘤干细胞或关闭肿瘤干细胞癌基因的表达是一条根本途径。

7 展望

脑胶质瘤干细胞的研究目前仍处于起步阶段,存在许多尚未解决的问题,如:BTSC特异性的标记物;BTSC的鉴定;BTSC的来源;BTSC分化机制;BTSC耐药性的机制等等。随着BTSC研究的不断深入,我们对脑肿瘤的起源、转移、复发和耐药性有了新的认识,对脑肿瘤的诊断和治疗也有了新的思路,将针对于肿瘤细胞的治疗转移到针对于BTSC上来,从而达到根治脑肿瘤的目的。

参考文献:

[1] Singh SK,Clarke ID,Terasaki M,et al.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].Cancer Res,2003,63(18):5821-5828.

[2] Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,et al.Identification of human brain tumors initiating cells[J].Nature,2004,432(7015):396-401.

[3] Hemmati HD,Nakano I,Lazareff JA,et al.Cancerous stem cells can arise pediatric brain tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(25):15178-15183.

[4] Yuan X,Curtin J,Xiong Y,et al.Isolation of cancer stem cells from adult glioblastoma multiforme[J].Oncogene,2004,23(58):9392-9400.

[5] Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem Cells,cancer,and cancer stem cells[J].Nature,2001,414(6859):105-111.

[6] 黄强.胶质瘤起源细胞探讨[J].中国微侵袭神经外科杂志,2003,8(8):337-340.

[7] Lessard J,Sauvageau G.Bm i-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaem ic stem cells[J].Nature,2003,423(6937):255-260.

[8] Kondo T,Setoguchi T,Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(3):781-786.

[9] Lagasse E,Connors H,A l2DhalimyM,et al.Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo[J].Nat Med,2000,6(11):1229-1234.

[10] Fiegel HC,Gluer S,Roth B,et al.Stem-like cells in human hepatoblastoma[J]. Histochem Cytochem,2004,52(11):1495-1501.

[11] Kopper L,Hajdu M.Tumor stem cells[J].Pathol Oncol Res,2004,10(2):69-73.

[12] Holland EC,Celestino J,Dai C,et al.Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastom a formation in mice[J].Nat Genet,2000,25(1):55-57.

[13] Mckay R.Stemcells in central nervous system[J].Science,1997,276(5309):66-71.

[14] Rao G,Pedone CA,Coffin CM,et al.c-Myc enhances sonichedgehog-induced medulloblastoma formation from nestin-expressing neural progenitors in mice[J].Neoplasia,2003,5(3):198-204.

[15] 姜晓兵,周凤,姚东晓,等.人脑胶质瘤干细胞的培养及鉴定[J].脑与神经疾病杂志,2005,13(1):6-8.

[16] 李茗初,陈风华,邓永文,等.悬浮法培养C6胶质瘤细胞系和该细胞系中脑肿瘤干细胞的分离[J].中国现代医学杂志,2004,14(24):57-60.

[17] Recht L,Jang T,Savarese T,et al.Neural stem cells and neuro-oncology:quo vadis[J].J Cell Biochem,2003,88(1):11-19.

[18] Ignatova T N,WKukekov V G,LaywellE D,et al.Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro[J].Glia,2002,39(3):193-206.

[19] 王飞,黄强,董军,等.胶质瘤恶性进展相关基因表达谱中发育与分化基因的分析[J].中国神经肿瘤杂志,2003,1(3):134-139.

[20] 朱玉德,黄强.起源细胞分化障碍与胶质瘤发生的分子关系.实用肿瘤,2005,20:812-841.

(收稿日期2009-07-21)