鞘内注射盐酸奈福泮的镇痛作用

郭云翮

摘要 目的:采用大鼠切口疼痛模型,研究鞘内应用盐酸奈福泮的镇痛作用。方法:(1)观察切口疼痛大鼠的痛行为学,用累积疼痛评分法测定疼痛程度。(2)运用免疫组化技术观察奈福泮对脊髓背角c-fos基因表达的影响。结果:(1)手术组大鼠累积疼痛评分明显高于F组,术后IT奈福泮可明显降低术后疼痛引起的累积疼痛评分。 (2) 与S组相比,奈福泮ED50量82.6μg鞘内注射时明显抑制FLI-N的产生,作用主要产生在Ⅰ-Ⅱ层、Ⅴ-Ⅵ层。结论:(1)IT奈福泮对切口疼痛大鼠有镇痛作用。(2)IT注射奈福泮的抗伤害作用与抑制脊髓背角c-fos蛋白的表达有关。

[关键词] 奈福泮;鞘内注射;切口疼痛模型;C-Fos基因

[中图分类号] R181.8+1[文献标识码] A[文章编号] 1004-8650(2009)12-155-02

盐酸奈福泮(NFP)是一种新型非麻醉镇痛药,其作用与阿片受体无关。本研究的目的在于采用大鼠切口疼痛模型,观察鞘内注射奈福泮对术后大鼠的镇痛效应及脊髓后角c-fos基因表达的影响以探讨其抗伤害作用的机制。

1材料和方法

药品和试剂盐酸奈福泮注射液(NefopamHydrochlorideInjection,湖北同济奔达鄂北制药有限公司);羊抗兔c-fos多克隆抗体、PV-6001试剂盒、DAB显色剂 (北京中杉金桥生物技术有限公司);异氟醚(isoflurane,Rhone—Poulenc);麻醉机(Dragen)

鞘内置管 体重250~300g的雄性SD大鼠,由山西医科大学实验动物中心提供,以5%的水合氯醛0.6ml/100kg腹腔注射麻醉后,按扬建平法[1]在大鼠蛛网膜下腔植入PE10聚乙烯导管(实验药物均经所埋导管注入蛛网膜下腔),妥善固定,术毕给予20g/l利多卡因注射液20μl,凡是10s内两后肢不能负重、拖地以及针刺小腿无回缩等逃避反应,16～20min以后又恢复负重者为实验动物,饲养5天后用于实验。

切口疼痛模型的建立大鼠吸入1.4%异氟醚麻醉后,将其左后爪进行消毒,按Brerman等[2] 法从足底近端0.5 cm处向趾部作一长约1 cm的切口。切开皮肤,用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割,保持肌肉的起止及附着完整,按压止血,用细线缝合皮肤共两针即成切口疼痛模型。

行为学实验采用累积疼痛评分法[2]评定疼痛强度,待大鼠手术清醒后观察两后爪着地及负重情况,后爪被压迫发白表示负重,如后爪翘起不着地,记2分;如后爪着地但不负重,记1分;如后爪着地并且负重,记0分。从术后1h起每5分钟观察1次,每次1分钟,以1分钟内最常采取的姿势为标准,共观察1h,以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分。

动物及分组 根据序贯实验计算出奈福泮的ED50量为82.6μg。取置管成功SD大鼠15只,随机分为三大组,Nfp组、S组、F组。Nfp组鞘内注射奈福泮ED50量82.6μg行切口术,S组注盐水无药物,行切口术方法;F组不做手术只注盐水

组织采集和样本制备Fos表达的高峰时间为术后2h,因此切口疼痛模型建立2 h后采用5%水合氯醛( 0.6ml/kg)麻醉,开胸,暴露心脏,经左心室灌流固定。先用200 mL0.9%生理盐水快速灌流冲洗血液,继以4%多聚甲醛500 mL(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.4)持续灌注1 h左右,接着灌入300ml的20%蔗糖和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液的混合液。剪开椎板取腰膨大处脊髓在4%多聚甲醛中后固定2 h,而后放人20%的蔗糖PBS液中,置4℃冰箱过夜,冰冻冠状连续切片,片厚20μm,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5 min/次),3%H2O2灭活内源性过氧酶370C暖箱中孵育30min,加一抗(c_f0s抗体1:800),37℃ 湿盒孵育5h,4℃冰箱过夜滴加二抗(羊抗兔),37℃孵育1h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5 min/次),DAB显色30min,自来水充分冲洗,脱水、封固镜检,核内棕色颗粒为阳性产物,每组各有一张加PBS液替代c-fos一抗,作为免疫组化的阴性对照。

统计学方法数据均表示为均数±标准差。P﹤0.05有统计学意义。

2结果

1、鞘内给予奈福泮对切口疼痛大鼠行为学的影响。F组大鼠活动如常,双后爪着地且负重;S组大鼠的术侧足常翘起,偶尔着地,但极少负重;Nfp组术侧足可着地,并且负重。与F组相比,手术组大鼠累积疼痛评分均明显升高(P<0.01);与S组相比,Nfp组可明显降低累积疼痛评分(P<0.01)。

2、鞘内给予奈福泮对切口疼痛大鼠c-fos蛋白表达的影响。S组大鼠于左爪按Brennan法行手术后只注入NS,可使同侧L4-L6脊髓灰质c-fos蛋白表达明显增强,c-fos免疫阳性反应神经元(FLI-N)在各层均有分布,但主要分布在Ⅰ-Ⅱ层、Ⅴ-Ⅵ层,以Ⅰ-Ⅱ层分布最多。而Nfp组可明显抑制FLI-N的产生,它们的作用主要产生在Ⅰ-Ⅱ层、Ⅴ-Ⅵ层。

3讨论

本实验采用的外周伤害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型,此模型是由Brennan等于1997年提出的,施行此手术的大鼠表现自发性疼痛行为,机械性异常疼痛,机械性痛觉过敏,这些疼痛行为与临床上外科手术和术后状态一致[3,4]。

盐酸奈福泮(NFP)是一种新型非麻醉镇痛药,其作用与阿片受体无关,在临床广泛用于各种急慢性疼痛、内脏平滑肌绞痛及术后镇痛,对呼吸、循环系统无作用。目前对其镇痛机制意见不一。Novelli等[5]研究发现了奈福泮在电压敏感性钙通道和钙离子介导的途径中是通过抑制细胞内cGMP的形成起作用,能够抑制NMDA介导的兴奋性中毒而有中枢镇痛作用。本研究观察到术后大鼠IT奈福泮累积疼痛评分明显降低,显示出IT应用NFP有镇痛作用;同时抑制脊髓背角Ⅰ-Ⅱ层、Ⅴ-Ⅵ层的c-fos免疫阳性反应神经元的表达,表明NFP可能是通过抑制了与伤害性感受的传导有关的脊髓背角Fos阳性神经元的活动,抑制了中枢敏感化,阻止了伤害性感受在脊髓内的进一步传导,从而产生抗伤害作用。

参考文献

[1]杨建平,蒋豪,吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的改进[J].中华麻醉学杂志,1993,13:110.112.

[2]Brennan TJ.Vandenneulen EP.Gebhan GF.Characterization of a rat

model of ineisional pain[J].Pain,1996,64 :493·501.

[3]Iahn PK,Brennan TJ.Primary and secondary hyperalgesia in a rat

Model for human postoperative pain[J].Anesthesiology,1999;90;863-72

[4]Brennan TJ,Vandernealen E,Gebhart GF.Characterization of a rat

Model of incisional pain[J].Pain,1996;64;

Novelli A, Diaz-Trelles R, Groppetti A, Fernandez-Sanchez MT Nefopam inhibits calcium influx, cGMP formation, and NMDA receptor-dependent neurotoxicity following activation of voltage sensitive calcium channels[J]. Amino Acids. 2005 Mar;28(2):183-91. Epub 2005 Feb 18

(收稿日期2009-11-13)