时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白的临床评价

霍继炜

（抚顺市中心医院，辽宁 抚顺 113006）お

摘 要：目的：评价时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白的临床应用价值。方法：分别用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法进行AFP测定，进行相关性分析、精密度试验和线性分析。结果：两法呈正相关，都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。结论：应用时间分辨荧光免疫分析法检测AFP，具有灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，有着良好的发展前景。

关键词：甲胎蛋白；时间分辨荧光免疫分析；酶联免疫吸附

中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0104-02

甲胎蛋白（AFP）是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，分子量约68000，由96％蛋白质和4％的碳水化合物组成，成人由肝细胞产生，血清中含量极微。AFP是诊断肝癌最特异的标志物^[1]，其灵敏度和特异性已经达到甚至远远超过CT、MRT、同位素扫描、超声波检查和血清酶学检查，同时检测孕妇血清中的AFP含量可用于神经管缺损畸胎的筛查。这些领域均须对AFP进行定量测定，临床上检测AFP的方法有很多，本文采用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）对65份血清进行AFP测定，报告如下。

1 材料与方法

1.1 病人与标本

本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清学AFP检测阳性，经影像学、组织病理学检查确诊为原发性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL，EDTA抗凝。将其中15份血清混合后分装（用于精密度试验），置于-20℃冰箱中保存，集中测试。

1.2 仪器与试剂

TRFIA采用WALLAC公司生产的AutoDELFIA1235型全自动时间分辨荧光分析仪，测定试剂盒为苏州新波生物技术有限公司生产，自带标准物，检测过程均按照试剂盒说明书进行操作，ELISA采用美国Bioeheek公司产品，定量试剂盒为郑州博赛生物工程有限责任公司生产。

1.3 检测方法

（1）TRFIA。AFP标准品和样品25μL／孔→分析缓冲液200μL→室温慢速振动60min→洗板2次→已稀释（1∶50）的Eu3+标记溶液200μL→室温慢速振动60min→洗板6次→增强液200μL→室温慢速振动孵育5min→测定荧光值，自动计算AFP值。

（2）ELISA。稀释液100μL/孔→血清样本20μL→37℃孵育30min→洗板4次→酶标抗体150μL/孔→37℃孵育30min→洗板→显色→酶标仪450nm读数测定，自动拟合曲线并计算AFP含量。

1.4 统计学分析

用SPSS13.0进行数据整理和统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 相关性分析

用上述两种方法对50份受检血清进行AFP定量分析，测定结果作相关性分析，结果表明，两种方法差异无显著性（P>0．05），直线回归方程为：Y（TRFIA）=0.938X（ELISA）+0.988，r=0.94，两法呈正相关。

2.2 精密度试验

参照NCCLS的精密度评价方案^[2]，用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法分别对高、中、低3个浓度（参考值分别为800μg／L，170μg／L，5μg／L）的AFP质控血清进行重复性试验。结果显示，两种方法都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，见表1。

2.3 线性分析

取高值混合血清作6点倍比稀释，各复测3次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，与两种方法实际测定值比较进行线性分析，TRFIA回归方程为：Y=1.04X+7.26，r=0.96；ELISA回归方程为：Y=0.63X+45.31，r=0.91。TRFIA在0.72～1078ng／L范围内线性良好；ELISA在4.21～535ng／L范围内线性良好。时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。

3 讨论

时间分辨荧光免疫测定的基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作为荧光标记物，利用这类荧光物质寿命长的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效排除非特异性本底荧光的干扰而提高灵敏度。TRFIA法的固相技术，也是保持其灵敏度的一个重要因素，同时增强液在TRFIA中的作用特别重要，优质的增强液是提高检测灵敏度的另一个关键因素，加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍^[3]。TRFIA法的批内、批间精密度均比ELISA法好，这可能是由于TRFIA法利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，几乎完全消除了背景荧光的干扰，且试剂稳定性好，因而检测重现性好；ELISA法检测影响因素较多，另外，ELISA法定量AFP试剂盒的线性及标准问题是测定结果准确性的关键，ELISA法的“钩状效应”，即测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度随抗原浓度的增加而开始下降至不显色，容易造成假阴性结果。另外，TRFIA的线性范围更宽，也是因为TRFIA采用Eu3+作标记物，由于Eu3+发光信号具有宽线性，同时采用独特的荧光解离增强技术，即通过加入增强液，标记物Eu3+在DELFIA体系中有非常优良的可检测性，大大提高了TRFIA的检测线性。总之，应用时间分辨荧光免疫分析法检测AFP，具有灵敏度高、重复性好、稳定性好等优点，有着良好的发展前景。

参考文献：

［1］ 刘宝善.消化器官肿瘤学［M］.北京：人民卫生出版社，2004：475．

［2］ 杨昌国，许叶，张抗．精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用［J］．临床检验杂志，1999，17（1）：47-49．

［3］ 杭建峰，吴英松，李明．时间分辨荧光免疫分析的研究进展及应用［J］．热带医学杂志，2004，4（3）：340-342．

（责任编辑：姜付平）