复合振动对去势大鼠腓肠肌肌纤维的影响

陈建庭 邓轩赓 查丁胜 钟招明

基础研究

复合振动对去势大鼠腓肠肌肌纤维的影响

陈建庭 邓轩赓 查丁胜 钟招明

目的观察低强度复合振动对去势SD雌性大鼠腓肠肌肌纤维的影响。方法48只4月龄SD雌性未育大鼠随机平分为假手术对照组、去势对照组以及4种不同振动参数去势振动组（去势振动Ⅰ组：35～45 Hz，0.05～0.1 g；去势振动Ⅱ组：35～45 Hz，0.12～0.21 g；去势振动Ⅲ组：45～55 Hz，0.05～0.1 g；去势振动Ⅳ组：45～55 Hz，0.12～0.21 g），各组置于振动台上的时间均相同，仅对振动组施加相应参数的振动干预，实验时间13周。比较各组大鼠腓肠肌肌纤维比例及横截面积。结果大鼠卵巢切除后腓肠肌纤维比例改变，横截面积减小，4种参数的复合振动均可在一定程度上抑制此改变，其中振动Ⅳ组抑制腓肠肌纤维比例改变及横截面积减小的效应最明显。结论频率45～55 Hz、强度0.12～0.21 g的复合振动有助于抑制去势SD大鼠腓肠肌的肌萎缩改变。

卵巢切除术；骨质疏松；肌，骨骼；肌纤维；振动；大鼠

既往研究表明[1]，对低骨密度的年轻女性施加短时高频低强度为期1年的全身振动之后，其骨骼和肌肉质量均有明显增加。我们的前期实验亦证实[2]，频率为35～45 Hz、45～55 Hz，强度为0.05～0.1 g、0.12～0.21 g的短时复合振动有助于改善去势大鼠的骨质量，但对骨骼肌的影响尚不十分清楚。本实验观察了低强度复合振动对去势大鼠腓肠肌肌纤维的影响，以探讨其对骨质疏松大鼠腓肠肌肌纤维变化的预防作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器和试剂

自制复合振动仪（专利公开号：CN 101224159），CM1850冰冻切片机（LEICA），三羟基胺基甲烷（B.M America），无水硫酸铜（分析纯，广州化学试剂厂），ATP二钠（分析纯，Amresco），硝酸铅（分析纯，广州化学试剂厂），硝酸银（分析纯，广州化学试剂厂），氢氧化钠（化学纯，广州化学试剂厂）。

1.2 实验动物及分组

4月龄雌性未育SD大鼠48只，体重224～259 g，平均240 g，由广东省实验动物中心提供（SPF级）。

将48只大鼠随机分为12笼，每笼4只，按顺序编号，适应性饲养4周后，2笼为1组，随机平分为假手术对照（sham-operation control,SC）组、去势对照（ovariectomized control,OC）组、去势振动（ovariectomized vibration,OV）Ⅰ组、OVⅡ组、OVⅢ组及OVⅣ组，每组大鼠均为8只。

1.3 实验干预方法

双侧卵巢切除法造模，SC组大鼠仅切除双侧卵巢周围脂肪，OC组及4个OV组大鼠均切除双侧卵巢。术后1周切口愈合后，4个OV组均置于振动台上，按实验设计振动参数（OV I组：35～45 Hz、0.05～0.1 g；OVⅡ组：35～45 Hz、0.12～0.21 g；OVⅢ组：45～55 Hz、0.05～0.1 g；OVⅣ组：45～55 Hz、0.12～0.21 g）接受振动，每组每次振动20 min，每天1次，1周5次，休息间隔不超过2 d，实验时间13周。SC组及OC组亦置于振动台相同的时间，但不予振动。

1.4 腓肠肌切片ATP酶染色

每组随机选取6只大鼠进行腓肠肌标本切片。从冻存管中取出腓肠肌标本，迅速以锋利刀片纵横各切一刀分别获得腓肠肌横截面和纵切面。OTC包埋，冰冻切片机－25℃、5 μm超薄切片，硅化玻片贴片晾干。试剂配制与染色参照文献[3]完成。

1.5 切片图像处理

切片置显微镜下观察并拍照，采用Image-pro Plus 5.0图像分析系统对照片图像进行定量和定性分析。根据ATP酶染色深浅不同将肌纤维分为I型、IIa型和IIb型（由2名病理科实验人员共同确认），并按不同类型肌纤维分别计数，计算百分比并测量各型肌纤维横截面积（cross section area, CSA，图1）。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包，各测得值以x-±s表示，统计方法采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q法，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠无死亡脱落，振动组大鼠经3～4 d适应振动后，于振动台上活动无异常。

2.1 各组大鼠腓肠肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维比例的比较

图1 各组大鼠腓肠肌肌纤维横截面（ATP酶染色 ×10）以OVⅡ组为例，染色最浅的为I型纤维，染色最深的为Ⅱa型纤维，两者之间的为IIb型纤维。比较SC组与OC组，可以直观地看出卵巢切除后大鼠腓肠肌肌纤维CSA减小

各组大鼠腓肠肌肌纤维比例（ATP酶染色）比较结果见表1。切除卵巢后，与SC相比，OC组大鼠Ⅰ型纤维比例下降，Ⅱa型、Ⅱb型纤维比例上升。不同的复合振动干预后，与OC组相比，OVⅢ、OVⅣ组能有效改善I型纤维比例，复合振动对去势各组Ⅱ型纤维比例改善无显著作用。但OVⅣ组能有效维持Ⅱb型肌纤维比例。

2.2 各组腓肠肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维CSA的比较

各组腓肠肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维CSA的比较结果见表2。卵巢切除后，与SC组相比，OC组大鼠Ⅰ型、Ⅱb型肌纤维CSA显著下降。复合振动干预后，与OC组相较，所有卵巢切除振动组均显著提高腓肠肌Ⅰ型纤维CSA，OVⅡ、OVⅢ、OVⅣ组可显著提高IIb型纤维CSA。

3 讨论

预防和治疗骨质疏松性骨折的一个重要方面是降低非暴力跌倒概率，其主要途径是增加肌力，改善机体平衡能力。通常情况下，骨的最大应力来源于肌肉收缩[4]，肌力在调节骨的形态、尺寸、强度等方面具有重要作用，是影响骨形成的重要因素之一[5-7]。动物实验表明雌激素缺失可导致大鼠骨骼肌萎缩[8-10]，并影响萎缩骨骼肌的质量恢复[10]。

骨骼肌肌纤维型的构成和分布是阐明骨骼肌功能的重要依据之一。研究表明，人和动物单个骨骼肌纤维的酶活性存在极大差异，酶组织化学研究证实人类骨骼肌至少含有2种类型的肌纤维，即Ⅰ型纤维和Ⅱ型纤维[11]。Ⅰ型纤维含有高浓度的氧化酶类如琥珀酸脱氢酶，涉及有氧代谢；Ⅱ型纤维含有高浓度的糖酵解酶如磷酸化酶，主要涉及无氧代谢。不同类型肌纤维ATP酶的含量不同，在功能上也存在一定差别，因而通过酶组织化学染色可以将不同类型的肌纤维得以区分。肌球蛋白ATP酶染色是目前确定骨骼肌肌纤维型的方法之一[3]，不需要专用抗体，肌纤维染色结果清晰直观，因而一直被研究者采用。

表1 各组大鼠腓肠肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维比例的比较结果（%,n=6,x-±s）

表2 各组大鼠腓肠肌I型、II型肌纤维CSA的比较结果（μm2,n=6,x-±s）

我们的前期工作证实，一定的复合振动可以增加去势大鼠的腰椎骨密度，具有潜在的预防骨质疏松的作用[12]。在本组实验中，较之SC组，OC组大鼠腓肠肌出现显著变化，I型纤维比例降低而II型纤维比例升高，CSA下降。这说明骨质疏松大鼠在骨质量降低的同时，腓肠肌也随之相应改变。尽管这种改变对大鼠肌肉功能的影响尚不明确，但至少存在潜在的不利影响。

本组的实验结果显示，所有OV组大鼠的腓肠肌I型肌纤维CSA均可在一定程度上得以维持，且除OVⅠ组外的其余OV组均未见IIb型肌纤维CSA有明显降低。Falempin等[13]的研究表明，低强度高频率的振动训练有助于降低肌肉丢失的程度以及肌纤维CSA减少的幅度。我们的实验也证实，一定强度和频率的复合振动可抑制因卵巢切除所导致的肌萎缩，这可能有利于卵巢切除大鼠肌力的维持。在所有OV组中，OVⅣ组体重显著高于OC组，且OVⅣ组肌重比最高，I型和IIb型肌纤维CSA最大，因此我们推测OVⅣ组体重的显著增加可能也是最大程度抑制肌萎缩的结果之一。

肌肉功能的实现有赖于其特定肌纤维的正常比例。与复合振动抑制肌萎缩作用普遍有效不同的是，本组实验中仅OVⅢ、OVⅣ组I型纤维的比例明显增高，II型纤维出现了比例逐渐升高的趋势，提示复合振动对抑制卵巢切除大鼠肌纤维比例改变的作用相对有限，延长振动干预时间是否会有更好的结果尚有待进一步的实验研究。未能动态观察复合振动对卵巢切除大鼠腓肠肌肌纤维改变的作用是本实验设计上的一个遗憾，使本研究的外推性受到一定限制。

Edstrom等[14]的研究显示大鼠肌肉体积减少与肌力下降密切相关。而肌纤维直径变化是对肌负荷的适应性反应，负荷刺激后肌纤维肥大性改变也是运动能力提高的标志之一[15]。我们的实验表明复合振动可以有效地预防肌萎缩，具有维持肌肉体积的作用，由此可能有助于大鼠肌力的维持，进而提高平衡能力。此外，振动对机体平衡能力的直接改善也得到了实验证实。Ebersbach等[16]报道，仅4周的振动干预即可使帕金森病患者的身体平衡能力和步态稳定性获得显著改善；而Kawanabe等[17]的研究也证实了全身振动对老年人肌力、平衡能力及步行稳定性方面的明显改善作用，且该方式对老年人群是安全的，并有较好的耐受性。由此推测复合振动也可维持或改善机体的平衡能力。

我们的研究表明，频率45 Hz～55 Hz、强度0.12 g～0.21 g的复合振动可以有效抑制卵巢切除大鼠腓肠肌萎缩以及肌纤维比例的改变，抑制肌力的衰退，可能具有维持或改善卵巢切除大鼠机体平衡能力的作用，目前相关机制尚不清楚，值得进一步研究。

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12邓轩赓,陈建庭,冯鹰,等.复合振动预防去势大鼠骨质疏松的实验研究[J].中国康复医学杂志,2008,23(4):325-329.

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14 Edstrom E,Ulfhake B.Sarcopenia is not due to lack of regenerative drive in senescent skeletal muscle[J].Aging Cell, 2005,4(2):65-77.

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（本文编辑 白朝晖）

Effect of compound vibration on gastrocnemius muscle fibers in ovariectomized rats

CHEN Jian-ting*,DENG Xuan-geng,ZHA Ding-sheng,ZHONG Zhao-ming.*Department of Orthopaedics and Spine center, Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Objective To observe the effect of compound vibration with low intensity on gastrocnemius muscle fibers in ovariectomized rats.Methods Fourty-eight 4-months old SD rats were randomly divided into 6 groups (n=8):sham-operation control group(SC),ovariectomized control group(OC),ovariectomized vibration groupⅠ(OVⅠ,35-45 Hz,0.05-0.1 g),groupⅡ (OVⅡ,35-45 Hz,0.12-0.21 g),groupⅢ (OVⅢ,45-55 Hz, 0.05-0.1 g)and groupⅣ (OVⅣ,45-55 Hz,0.12-0.21 g).The experiment started at 1 week after ovariectomy and the two control groups received no intervention except the noise of machine while the experimental groups were treated with vibration.The entire experiment lasted 13 weeks.The ratio types and cross section area(CSA) of gastrocnemius muscle fibers would be compared among groups by the end of testing.Results Ratio of gastrocnemius muscle fibers types from SD rats changed and CSA decreased after ovariectomy,but these changes could be inhibited by the intervention of compound vibration,especially by the vibration with 45-55 Hz frequency and 0.12-0.21 g magnitude.Conclusion The compound vibration(45-55 Hz,0.12-0.21 g)can help to inhibit the changes of gastrocnemius muscle atrophy in ovariectomized SD rats.

Ovariectomy;Osteoporosis;Muscle,skeletal;Muscle fibers;Vibration;Rats

R681.4,R49,R361.1

A

1674-666X(2009)02-0113-04

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.009

广东省自然科学基金（06024394）

510515广州，南方医科大学南方医院脊柱骨病科（陈建庭、查丁胜、钟招明）；610041成都，四川省骨科医院脊柱骨科（邓轩赓）

E-mail：chenjt99@vip.sina.com