pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体的构建及鉴定

陈丽红 刘景丰 方航荣 邱明链

[摘要] 目的 构建带有报告基因EGFP的hIL-10真核表达载体。方法 通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因,构建IL-10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定,紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP-hIL-10载体序列正确。结论 成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。

[关键词] 基因;IL-10基因;真核表达载体;载体构建

[中图分类号] Q754[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)34-01-03

Construction and Identification of pIRES2-EGFP-hIL-10 Plasmid

CHEN Lihong1LIU Jingfeng2FANG Hangrong1QIU Minglian2

1.Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;2.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China

[Abstract] Objective To construct the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid of human. Methods IL-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using RT-PCR,and then pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was constructed. The identification was done by using endonuclease cutting,PCR and sequencing and the plasmid concentration and purity were detected by using UV spectrophotometer. Results Endonuclease cutting. PCR andsequencing showed the successful construction of pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid.Conclusion We construct pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid successfully and lay the foundation for immunotolerance researchesin the organ transplantation.

[Key words] Gene;IL-10 gene;Eukaryotic expression vector;Vector construction

白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)是最初由Mosman等1989年发现的一种由Th2分泌的细胞因子,它能抑制Thl细胞因子的分泌。近来,越来越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性细胞的激活和细胞因子产生的作用,与移植物排斥有密切关系,因此在器官移植领域,越来越多的研究表明,IL-10能通过多种途径来抑制或减轻排斥反应,从而延长移植物的存活时间。我们通过构建hIL-10真核表达载体为今后在器官移植免疫耐受的进一步实验研究提供依据。

1材料与方法

1.1外周血单核细胞的制备

取正常人新鲜抗凝血5mL与Hanks液等量混匀后,加于4mL淋巴细胞分离液上,离心收集细胞,用5mL含10%的胎牛血清1640CM培养液悬浮,加入25mg/L的ConA,于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h。

1.2RT-PCR扩增人IL-10基因

淋巴细胞经ConA刺激后,用Trizol试剂按说明书提取总RNA。逆转录体系为:模板RNA溶液5μL,5×RT buffer 4μL,dNTP(各10mmol/L) 混合物2μL,RNA酶抑制剂0.5μL,引物设计参照GenBank上人IL-10基因序列分别设计引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAG CCACC ATGCACAGC TCAGCACTGCTCT,下游引物:IL-10R:CCGGAATTC TCAGTTT CGTATCTTCATTGTC。Oligo(dT) 引物1μL,AMV返转录酶1μL,DEPC水6.5μL。42℃保温1h,置95℃温育5min 使AMV逆转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR。目的片段大小约540bp。PCR反应条件:94℃预变性2min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V,30min),凝胶成像系统摄像。

1.3真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL10的构建

1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物,连同pIRES2 -EGFP空载体,经Xho I和EcoR I 双酶切后,T4 DNA 连接酶4℃过夜连接,连接产物按常规方法转化于DH5a 感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养,采用HiSpeed Plasmid Midi Kit 质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质粒,详见说明书。

1.4真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL10鉴定

1.4.1限制性内切酶酶切、电泳及片段回收取IL-10质粒抽提产物用(CTCGAG CCACC ATG)和(GAATTC TCA)双酶切,反应体系:Xho I 1μL,EcoR I 1μL,10×K Buffer 2μL,重组质粒(118μg/mL)5μL,灭菌双蒸水11μL,反应混合液混匀后置37℃酶切过夜后,1%琼脂糖电泳(100V,30min)凝胶成像仪成像。

1.4.2PCR法鉴定hIL-10目的基因片段IL-10基因上游引物:5 ATGC ACAG CTCA GCAC TGCT CT 3,下游: 5 TCAG TTTC GTAT CTTC ATTG TC 3,预期产物大小为450bp。

反应总体积25μL,反应体系如下:10×Buffer 2.5μL,灭菌双蒸水17.375μL, dNTP mixture(各2.5mM)2μL,上游引物(10μM)1μL,下游引物(10μM)1μL,菌液1μL,Taq(5U/μL)0.125μL,总体积25μL。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃延伸7min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V,30min),凝胶成像系统摄像。

1.4.3测序取质粒抽提产物1mL,用通用引物送博亚公司测序。

2结果

2.1hIL-10基因的PCR产物电泳分析

琼脂糖凝胶电泳结果显示,PCR扩增产物均为一条带,对比Marker,大小同预期结果一致(图1)。

2.2重组质粒的酶切鉴定

紫外灯下定位切取所需DNA片段凝胶条,重组质粒pIRES2 -EGFP-hIL-10酶切后显示2kb和540bp两个条带(图2)。

2.3重组质粒测序鉴定

重组质粒pIRES2-EGFP-hIL-10抽提产物测序结果(图3),经Genebank的序列比对,两重组目的基因序列完全正确。

2.4重组质粒的结构图(图4)

2.5紫外分光光度计测定中量抽提质粒确定浓度及纯度(表1)

3讨论

白细胞介素10(Interleukin10,IL-10)最初于1989年由Fiorentino等发现,他们证明IL-10由Th2淋巴细胞和单核细胞合成分泌,具有抗炎和抑制多种细胞因子合成的作用,所以称之为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor,CSIF)[1]。人IL-10(hIL-10)基因定位于第一号染色体上,编码178个氨基酸,其中含18个氨基酸疏水信号序列,成熟蛋白含160个氨基酸。IL-10的生物学功能主要有IL-10能抑制抗原特异的T细胞增殖和分泌致炎细胞因子。IL-10能直接作用于T细胞上的CD28协同刺激受体,阻断CD28酪氨酸磷酸化过程和CD28分子介导的信号传导通路,从而有效抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,诱导T细胞耐受。此外,IL-10还可以通过特异的抑制T细胞IL-2的分泌而抑制T细胞的增殖[2]。IL-10这种抑制T细胞分泌IL-2,TNF-α,IFN-γ的作用可使机体的迟发性变态反应受到抑制。此外,IL-10通过抑制IFN-γ的产生抑制NK细胞的活性。它对单核细胞和巨噬细胞的影响也主要是抑制性的。总之,IL-10的这些生物学活性显示其为一种潜在的免疫增殖反应和炎症反应的负性调节因子[3-6],是一种针对同种异体器官移植的有益的细胞因子。

目前的转基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。其中病毒载体较有效,是目前基因治疗的主要手段,但病毒载体存在一些缺陷,包括安全性、免疫原性、对靶细胞有一定的毒性、非导向性。有限的携带能力,生产和包装问题、成本高昂等,限制了其推广应用。非病毒类价格比病毒低廉且安全,较少产生抗原性[7]。

荧光蛋白标记技术是近年来迅速发展的一种新型细胞示踪技术,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP) 基因片段较小,易于构建融合蛋白,本实验中选用的pIRES2-EGFP表达载体,进入靶细胞后,具有安全性好,容量大等特点。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因,使EGFP的荧光强度提高了35倍,而且转染16～24h后仍可稳定表达,由于EGFP报告基因检测非常方便,有别其他报告基因检测需加入底物,具有直观、及时、应用范围广的特点,是其他报告基因所无法比拟的。我们首先从人外周血分离得到淋巴细胞,通过分子克隆的手段得到了人IL-10基因,并成功的构建出带有报告基因EGFP的pIRES2- -hIL-10真核表达载体,目的基因进行了序列测定和相似性比对,结果显示与GeneBank基因序列完全一致。同时,酶切、PCR鉴定结果显示构建成功。这将为下一步研究IL-10在诱导器官移植免疫耐受中的作用奠定前期基础。

[参考文献]

[1] Fiorentino DF,Bond MW,Mosmann TR. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones[J]. J Exp Med,1989,170(6):2081-2095.

[2] 傅继东. 白介素-10、树突状细胞及免疫耐受[J]. 国外医学:免疫学分册,2001,24(3):133-136.

[3] Steinbrink K, Graulich E, Kubsch S,et al. CD4(+) and CD8(+) anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity[M]. Blood, 2002, 99(7):2468-2476.

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[5] Silva SR,Jacysyn JF,Macedo MS,et al. Immunosuppressive components of Ascaris suum down-regulate expression of costimulatory molecules and function of antigen-presenting cells via an IL-10-mediated mechanism[J]. Eur J Immunol,2006,36(12):3227-3237.

[6] Zhou X,Yang N,Lu L,et al. Up-regulation of IL-10 expression in dendritic cells is involved in Trichosanthin induced immunosuppression[J]. Immunol Lett,2007,110(1):74-81.

[7] Zhang Y,Sekirov L,Saravolac E,et a1. Stabilized plasmid lipid particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties[J]. Gene Ther,1999,6:1438-1447.

(收稿日期:2009-09-11)