巴西橡胶树品系对棒孢霉落叶病的抗病性鉴定

张　贺　张　欣　蒲金基　漆艳香　谢艺贤　张辉强

摘要采用巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌的分生孢子接种和其毒素接种分别测定了国内天然橡胶主产区9个主栽品系的抗病性，结果表明过滤灭菌毒素划伤接种橡胶离体小叶片可以产生与分生孢子接种相似的症状，而不划伤接种则不产生病害症状；121℃、20 min湿热灭菌毒素接种无论划伤与否均不产生病害症状；分生孢子和病原菌毒素两种接种方法所测橡胶品系的抗病性之间有很好的一致性，说明毒素接种可以用来代替病原菌接种测定橡胶品系的抗病性。抗病性测定结果显示，供试9个巴西橡胶树品系中，PB86、热研88-13、南华1、PR107、热研7-33-97对病原菌表现出高抗，而RRIM600、南强1-97、热研44-9则表现高感，GT1则表现中感。

关键词巴西橡胶树；多主棒孢；毒素；抗病性

中图分类号S 432.21

棒孢霉落叶病[Corynes pora cassiicola(Berk.&Curt.)wei]是巴西橡胶树的一种毁灭性病害，主要侵染叶片、枝条，造成橡胶树周年反复落叶甚至幼树死亡，严重降低于胶产量。巴西橡胶树棒孢霉落叶病于1958年首次报道发生于印度，20世纪50～80年代在亚太和非洲的主要产胶地区相继发生，并于20世纪90年代开始在这些地区胶园流行，导致大量橡胶园被迫更新，至今仍严重影响着该地区的天然橡胶产业。鉴于该病严重威胁世界天然橡胶产业健康发展，国际橡胶研究与发展委员会要求各天然橡胶生产国严密监视该病的发生传播。我国是世界天然橡胶的第六主产国和第一消费大国，天然橡胶产业是海南、云南等省的重要经济支柱，该病的发生严重威胁我国天然橡胶资源安全。2007年蒲金基等首次报道在我国橡胶苗圃发生巴西橡胶树棒孢霉落叶病。为进一步了解我国橡胶主栽品系对巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌的抗性情况，笔者采用病原菌的分生孢子接种和毒素接种法测定了国内天然橡胶主产区的9个主栽品系对该病害的抗病性。

1材料与方法

1．1供试的巴西橡胶树品系

本试验供试的巴西橡胶树品系均是国内天然橡胶主产区的主栽品系，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。品系如下：南强1-97、热研44－9、PB86、热研88－13、GT1、南华1、热研7－33－97、RRIM600、PR107。

1．2供试的菌种

供试菌种由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，菌株编号为CFCC82971，该菌株单孢分离于海南省儋州市宝岛新村的幼龄胶园。

1．3供试叶片的选取

取上述不同品系的老化程度一致的淡绿色叶片，取0.8％NaC10消毒5 min，清水冲洗3次，正面向上平放在垫有湿润滤纸的保鲜盒内，100％湿度下室温保湿备用。

1．4不同品系对病原菌分生孢子的抗病性鉴定

1．4．1病原菌分生孢子的获得

将病原菌接种到PDA平板上，5 d之后刮取菌丝转移到保湿的卫生纸上，室温下保存4 d。配制成孢子含量约为40个/视野(10倍×10倍)的悬浮液。

1．4．2不同品系对病原菌分生孢子的抗病性鉴定

每个品系选取大小一致的离体叶片6片、每个叶片正面选取3个侧脉、每个侧脉上划伤接种1滴(约40μL)孢子悬浮液，室温保湿。设置清水对照和空白对照。5 d后观察并记录病害严重度，计算平均病害严重度。

1．5不同品系对病原菌毒素的抗病性鉴定

1．5．1病原菌毒素的获得

将供试菌株接种到PDA平板上，从培养5 d菌落边缘打出长势一致的菌饼(d=4 mm)接种到Cza—pek培养液(5个/100 mL)中，把三角锥瓶置于摇床(150 r/min)在28℃黑暗条件下培养21 d，即可获得含有病原菌毒素的培养液。

将获得的培养液用定性滤纸过滤3次，取部分滤液用细菌过滤器进行过滤除菌，获得过滤灭菌的病原菌粗毒素；部分滤液经过121℃、20 min湿热灭菌后获得湿热灭菌粗毒素。灭菌后的粗毒素置于4℃保存备用。

1．5．2不同品系对病原菌毒素的抗病性鉴定

分别取过滤灭菌粗毒素和湿热灭菌粗毒素接种到巴西橡胶树的离体叶片的侧脉上，分划伤或不划伤两种接种法。每个品系选取大小一致的离体小叶片6片、在每个小叶片的正面选取3个侧脉、每个侧脉上接种1滴灭菌后的粗毒素(约40 μL)，设置清水对照和空白对照。5 d后观察并记录病害严重度，计算平均病害严重度。

2结果与分析

2．1病原菌分生孢子接种抗病性鉴定结果

试验结果表明，分生孢子可通过伤口侵入，发病的病斑与自然环境中的病斑症状极其相似，在叶片上早期产生深褐色圆形或不规则形小病斑，病斑周围有明显黄色晕圈，后期病斑扩大，圆形或不规则，中央红褐色或灰白色，纸质，有时形成穿孔，病斑外缘深褐色或红褐色，周围有明显的晕圈，病斑周围叶脉呈现黑色坏死，形成本病特征性的“鱼骨”或“铁轨”症状。并能通过组织分离获得与供试菌株菌落形态相似、分生孢子形态、大小相似的菌株。从而证明离体叶片所接种部位发病是有病原菌侵染所致。结果还表明供试的巴西橡胶树品系PB86、热研88—13、南华1、PR107、热研7-33-97对病原菌表现出高抗，而RRIM600、南强1-97、热研44-9则表现出高感，GT1则表现中感(表1)。

2．2病原菌毒素接种法抗病性鉴定结果

试验结果表明，过滤灭菌的毒素可以致使划伤的离体叶片表现与病原菌活体接种相似的病害症状，即组织尤其叶脉呈现黑色坏死，产生典型的“鱼骨”或“铁轨”症状，但毒素不划伤接种则不表现病害症状；121℃、20 min的湿热灭菌后的病原菌毒素不具有活性，不能致使划伤或不划伤的叶片表现病害症状。用过滤灭菌毒素接种划伤叶片法所测9个品系的抗病性(表1)与分生孢子接种法所测结果之间有很高的一致性(r=0.9599，t=8.389，t_0.01，8=3.355)。

3结论与讨论

本文采用国内天然橡胶主产区的9个主栽品系对病原菌的分生孢子及其毒素进行了抗病性鉴定，结果表明过滤灭菌毒素划伤接种橡胶离体叶片可以产生与分生孢子接种相似的症状，而不划伤接种则不产生病害症状。说明毒素在病原菌侵入时并不起决定作用，而是在病原菌成功侵入后才发挥作用，促进病原菌的扩展。121℃、20 min湿热灭菌毒素接种无论划伤与否均不产生病害症状，这与Lamotte等报道的相一致。C.cassiicola所产毒素Cassiico—lin是一种约26ku的小分子量蛋白，湿热灭菌后会使小分子量蛋白变性而失去活性。Cassiicolin是一种专化性毒素，是该病原菌的主要致病因子之一，国外已有学者将其用于橡胶品系抗病性鉴定。本文采用分生孢子和病原菌毒素两种接种方法所测橡胶品系的抗病性之间有很好的一致性(r=0.959 9，t=8.389，t_0.01，8=3.355)，也说明毒素接种可以用来代替病原菌接种测定橡胶品系的抗病性。由于毒素的获得和保存方法均较为简便，适合于大规模橡胶品系的抗病性鉴定，这也是本试验采取毒素接种的原因之一。

印度、马来西亚、斯里兰卡、喀麦隆等国家橡胶树棒孢落叶病的发生历史表明，病害发生早期只限于苗圃，然后在胶园个别品系或个别地区零星发生。病原菌存在明显变异和分化，极易产生强致病力的菌株，强致病力的菌株在苗圃暴发流行，然后在胶园感病品系上大面积流行，造成严重的损失。如斯里兰卡1985年首次在一苗圃发现该病，经过2年时间，病害就传播扩散到该国几乎所有胶园。目前该病在我国主要在橡胶实生苗圃发生，定植胶园发生极少，本文所选用的菌株是首次在我国幼龄胶园采集分离的一个菌株，了解我国主栽品系对该菌株的抗病性，可以为我国开展风险评估提供参考依据。抗病性鉴定结果显示，供试的巴西橡胶树品系中的PB86、热研88-13、南华1、PR107、热研7-33-97对病原菌表现出高抗，而RRIM600、南强1-97、热研44-9则表现出高感，GT1则表现中感，这些感病品系在我国均有不同面积的栽培，棒孢落叶病有可能在上述感病品系上暴发流行。

面对橡胶树棒孢落叶病对我国天然橡胶产业的潜在威胁，及时开展橡胶树棒孢落叶病检测技术研究、建立区域性的监测体系；在我国橡胶主产区开展多菌株对多品系的致病性测定、优化毒素的提取方法，运用毒素筛选优良的抗病品系，严密监控橡胶棒孢落叶病的传播发生情况，重点监测感病胶园的病害动态；开展病害生物学与生态学研究、评估其危险性，为决策提供依据、发展防控技术、有效提高应对病害的能力，对保障我国天然橡胶生产、供给、胶林生态安全具有重大的意义。