现代分子生物学技术在木霉鉴定及多样性分析中的应用

董　楠　许艳丽

摘要木霉是一类重要的生防真菌，具有很大的农业应用潜力。对分离培养的木霉准确鉴定，对其在农业生产中的应用至关重要。近年来，分子生物学技术在木霉鉴定方面得到了广泛应用，本文综述了rDNA-ITS序列分析、通用引物PCR(UP-PCR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)等分子技术在木霉鉴定与多样性分析中的应用。

关键词木霉；DNA寡核苷酸条形编码；UP-PCR；RAPDAFLP

中图分类号S 154.3，Q 789

木霉属真菌(Trichoderma spp.)是一类普遍存在的丝状真菌，是土壤微生物的重要组成群落之一。该菌易于分离培养、生长迅速，能够产生几丁质酶、纤维素酶以及蛋白酶等多种酶类，能够利用多种底物来抵抗某些有害化合物(氰化物等)的毒害。同时，木霉能够拮抗多种农作物的病原菌、促进农作物生长、诱导其产生抗性，是一类重要的植物病害生防菌，具有极大的农业应用潜力。目前，全世界已有40多个国家开展了木霉的相关研究，已研制出50余种木霉的商品化生防菌剂；我国近年在该领域的研究与应用也取得了重要进展。

木霉属真菌是一个庞大的家族，迄今已鉴定的超过100种，由于每种木霉在生防功能与代谢产物上都不尽相同，因此，对木霉进行准确鉴定和分类，对其在农业生产中的应用至关重要。传统的生物学鉴定主要依据形态学方法，即根据属间不同种的形态学和生殖器官分化特征来鉴定种。然而真菌的形态性状复杂多变且易受环境影响，同一属不同种的形态往往又极其相似，难以区分，这需要研究者具备丰富的形态学鉴定经验。现代分子生物学方法的介入为木霉的鉴定及分类学研究开辟了一条新的途径。人们在分子鉴定方面进行了许多尝试，大大提高了鉴定效率及分类的准确性。本文就目前国内外分子生物学技术在木霉鉴定及多样性分析方面的应用进行阐述，希望能为木霉的快速准确鉴定提供帮助。

1核酸序列分析与DNA寡核苷酸条形编码的应用

核酸序列分析是通过测定基因中核苷酸序列的组成来比较同源分子间相关性的方法，是目前最常用的物种鉴定方法之一。由于某些基因的序列内部存在能够阐明个体间遗传关系的系统发育标记(能够区别遗传关系接近的基因片段，因此有的放矢地分析这些系统发育标记，能够达到物种分类鉴定及多样性分析的目的。Kopchinskiy等在NC—BI BLAST的基础上开发了TrichoBLAST搜索工具(http：//www.isth.info/tools/blast/index.php)，是用于序列相似性研究的在线数据库，专门用于木霉属及其有性型肉座菌属(Hypocrea spp.)物种的序列比对分析和鉴定。其中含有内转录间隔区(ITS区)、转录延伸因子I a亚基基因(tefl)及RNA聚合酶第二亚基(rpb2_exon)基因等3类木霉属与肉座菌属系统进化标记的数据信息。其中，ITS区(ITSl、5.8s和ITS2)既具保守性，又在科、属、种水平上具有特异序列，一直被用于真菌的系统进化研究；tefl基因是编码转录延伸因子I a亚基蛋白的基因，包括3个系统发育标记，分别是第4、第5内含子(4th、5th intron)和第6外显子(6th ex—on)，这3个标记能够不同程度地区分物种；rpb2基因也被用于微生物的分类研究中，但使用频率不及前两者高。

将待研究序列输入TrichoBLAST程序中比对，系统将自动检索未知序列中的系统发育标记，进而给出与已知序列具有不同相似程度的物种。这种方法简单方便，但缺点是给出的结果是模糊的，需要研究者在比对结果的基础上根据经验进行判断。

为克服这一问题，Druzhinina等在“DNA条形编码”技术的基础上，研究了用“DNA寡核苷酸条形编码”(DNA oligonucleotide barcode)对木霉及肉座菌属的菌株进行鉴定的方法，能够给出确切的鉴定结果。DNA条形编码(DNA barcoding)即应用单一片段基因序列来区分所有物种，达到物种鉴定的目的，如同超市中的条形码，它隶属于DNA分类的范畴，用于生物体分类及多样性研究。自Hebert等提出这一理论以来，该技术已先后被应用于部分动物、原生动物以及昆虫的鉴定与分类研究中。Druzhinina等第一次将该理论应用到真菌的研究中，他们是在考察了木霉与肉座菌属88个菌株的979段序列，共计135个ITSl和ITS2单元型序列的基础上研发出来的，就是应用ITS序列中不同位置上的几段特异的寡核苷酸序列共同鉴定木霉/肉座菌属菌株到属、进化支及种的水平，并将不同的序列片段作为定义木霉属及种的特异性标记，以条形码的形式，存储在MySQL数据库中，形成TrichOKey v.1.0和2.0程序(www.isth.ifo.TrichOKey v.1.0/2.0)，在线就可查到。该方法能够鉴定75个一元种(single species)，5个二元种(species pairs)以及1个三元种(speciestriplet)。使用这一程序不但能够得到未知序列的鉴定结果，并对鉴定结果的可靠性进行评价(“high”或“lOW”)，还能够获得该种木霉的属、进化支及种的特异性标记，为研究者设计特异性引物提供参考。应用该方法，作者选取本实验室保存的20余株不同培养性状的木霉进行鉴定，共鉴定出6个木霉种(T，har-zianum、T.viride、T.citrinoviride、T.virgns、T.aggressivum、T.pseudokoningii)；并根据特异性标记设计了木霉属特异性扩增引物(未发表)。

作为一种分子鉴定手段，该方法的优点为：(1)快捷性：能够给出确切的鉴定结果，这是它区别于BLAST的主要方面。(2)方便性：该程序充分考虑到使用者，即便使用者对木霉属与肉座菌属的分类情况知之甚少，也能够方便地获得鉴定结果，极大地提高了鉴定效率。(3)准确性：TrichOKey v.1.0/20数据库中包含5个属特异性标记及若干个种特异性标记，能够使研究者从每一步来检查结果的准确性。

2通用引物PCR结合交叉印迹杂交方法鉴定木霉属真菌

通用引物PCR(Universally Primed PCR，UP-PCR)是一种PCR指纹图谱技术，类似于RAPD(随机扩增多态性DNA)技术，可用于基因组结构研究、物种鉴定、种间与种内遗传关系分析以及种群多样性研究，将其与SCAR(特异序列扩增)标记技术结合使用，可用于监测释放到环境中的生防菌株。它的基本原理是根据聚合酶链反应(PCR)，用人工合成的一段16bp以上的通用引物，对待研究的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯

酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，形成PCR指纹图谱，利用扩增产物多态性进行物种鉴定及多样性分析。

由于木霉菌株拥有高度的基因组相似性，电泳后可以清晰地将种特异性条带显现出来，从而将不同种的木霉菌株分开，再将其指纹图谱与已知种的图谱进行比较，即可鉴定出未知菌株。如果指纹图谱与参考菌株的条带图有很大差异，可以进一步结合交叉印迹杂交(cross blot hybridization)的方法来研究未知菌株与参考菌株的同源性，进而确认种。

与RAPD技术相比，UP—PCR方法的主要优点是：退火温度更高(约55℃)，引物更长(＞16bp)，产生的条带更复杂(最多可达100条)，重复性更好，这些都克服了RAPD技术的缺点。国际木霉与肉座菌属分类委员会网站上对该方法有系统阐述，包括引物序列、反应体系及反应条件等。Lubeck等最先应用该方法研究木霉与粘帚菌(Gliocladiumspp，)的亲缘关系，认为该方法具有区别亲缘关系相近菌株的能力；并将其用于鉴定丹麦建筑物污水中分离出的44株木霉，共鉴定出6个木霉种(T.atroviride、T.citrinoviride、T.harzianum、T.kongibrachiatum、T.viride和T.hamatum)，分别属于3个不同的进化组(section Longibrachia—turn、section Pachybasium和section Trichoder—ma)。他们认为该方法可用于区分木霉的集合种(Trichoderma viride/atroviride/koningii)，并可发展成为木霉菌株的常规鉴定方法。近年来，UP-PCR方法除用于木霉种的鉴定外，还被用于植物病原菌及其他生防菌的多样性分析，如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和粉红聚孢霉(Clonos—tachys rosea)等。

3RAPD技术在木霉鉴定及多样性分析中的应用

随机扩增多态性DNA(random amplified poly—morphic DNA，RAPD)技术是目前在真菌多样性分析中应用最为广泛的一种分子生物学方法之一。其基本原理是应用随机引物对目标基因组DNA进行PCR扩增，经电泳分离，扩增产物所呈现的不同条带图谱，反映了基因组相应区域的DNA多态性。在木霉的遗传多样性与种群多样性分析中，RAPD技术也是应用最早，研究成果最多的一种分析手段，进而被用于木霉的分子鉴定。Dubey等应用RAPD方法分析具有生防作用的木霉，找到能够有效区分3种生防木霉(T.viride、T.harzianum及T.virens)的RAPD引物。Singh等研究了引起蘑菇病害的18株木霉，通过结合ITS序列比对方法鉴定为T.harzianum和T.virens，并应用RAPD分析了其种间及种内多样性。李梅云等运用RAPD技术对18个木霉菌株的基因组DNA进行多态性分析，认为RAPD遗传标记木霉可以作为该菌分类的有效手段之一。

与其他分子标记技术相比，RAPD具有以下特点：①PCR反应灵敏度高、样品用量少；②引物具有通用性，无需预知物种DNA序列；③操作简便迅速，实验成本低，无放射性污染；缺点是重复性差。近年来，RAPD技术与多种指纹图谱分析软件相结合，提高了对不同物种种问及种内多态性确认的准确性，在鉴定大量样品时，在不能将所有样品进行测序的情况下应用RAPD技术，其操作简便且试验成本低的特点，可以极大地提高鉴定效率。

4AFLP技术分析木霉多样性

1995年Vos和Zabeau等建立了扩增片段长度多态性(amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)方法。它是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。用限制性内切酶酶切不同菌株的基因组DNA，产生大小不同的限制性片段，使用人工接头将其连接，作为模板。用含有选择性碱基的引物对模板进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据DNA指纹图谱的差异来检验多态性。该方法广泛应用于遗传多样性分析及品质鉴定等方面的研究。

Buhariwalla等首先将该技术应用于分离自印度4个花生种植地的48株木霉的多样性分析及种质鉴定中，并结合28S rDNA序列分析技术，通过6对引物的联合使用，共得到234个多态性条带，鉴定出8个木霉种(T.pubescens、T.hamatum、T.koningii、T.viride、T.atroviride、T.longi—brachiatum、T.inhamatum及T.harzianum)。他们认为AFLP条带能够对木霉种及黄曲霉种进行鉴定，区别亲缘关系相近的种，扩增子能够用于诊断分离到的生防木霉。

该技术的主要优点是：(1)多态性丰富，很少的引物即可获得50～100条扩增条带；(2)受环境影响小，多为共显性表达、无复等位效应；(3)灵敏度高，重复性好，带形稳定；(4)无需已知DNA序列；主要缺点是：分析费用高，操作复杂；对DNA纯度及内切酶质量要求高。

综上所述，在木霉的分子鉴定与多样性研究中，不断有研究者将新的方法应用到该领域；并将其加以改进，不断完善。表1总结了上述4种方法的主要特点，还有其他鉴定方法在木霉研究中应用不多，这里不再赘述。依据这些特点，人们可以根据其试验目的及试验条件加以选择，从而得到准确的鉴定与分析结果。

5展望

随着核酸测序技术的普及及各种分子标记方法的不断完善与发展，在微生物研究领域中，对于微生物的鉴定已经从依赖于传统的形态学及生理生化鉴定的时期逐步过渡到依靠分子生物学手段进行种质鉴定与系统发育分析的研究阶段，但这并不能取代传统的鉴定方法，而是对生理生化及形态学方法的补充。每种方法都有各自的优点与不足，都需要其他鉴定信息的互相印证才能得到准确的结果。在科技迅猛发展的今天，一些新兴的分子生物学技术也将逐步应用到木霉的监测及多样性分析之中，如实时荧光定量PCR(real time PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术等。Cordier等将RAPD、SCAR及real time PCR技术相结合，用于检测Trichodermaatroviride生防菌株在土壤中的生长繁殖情况；Yergeau等应用DGGE技术对芦笋中镰刀菌属的种群多样性进行研究，相信在不久的将来这一方法也能够应用到木霉的多样性分析中。

现代分子生物学技术的应用为木霉属真菌的分类鉴定提供了一条崭新的途径，极大地促进了木霉分类学的发展，提高了鉴定效率，使快速准确鉴定成为可能。近年来，随着人们对可持续发展及绿色农业要求的逐步提高，木霉作为重要的土壤生防因子必将得到进一步的研究与应用，对木霉鉴定方法的深入探讨，不但能够促进木霉的分类与生防作用的研究，也必将对其物种与多样性、生态学与地理分布等多方面的研究产生深远影响。